限制性内切酶以内切方式水解核酸链中的磷酸二酯 键， 产生的ＤＮＡ片段５’端为Ｐ，３’端为ＯＨ。
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1. 限制性内切酶的类型
根据限制酶的识别切割特性， 催化条件及是否具有修饰酶活 性可分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三大类。
第一类（I型）限制性内切酶能识别专一核苷酸顺序，在识别 位点很远的地方任意切割DNA链，切割核苷酸顺序没有专一 性，随机。这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中 用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因。这类酶如 EcoB、EcoK等。
它们能识别双链ＤＮＡ的特异顺序，并在这个顺序内进行 切割，产生特异的ＤＮＡ片段；
Ⅱ型酶分子量较小，仅需Mg2+作为催化反应的辅助因子，识 别顺序一般为４～６个碱基对的反转重复顺序；
Ⅱ型内切酶切割双链ＤＮＡ产生３种不同的切口－－５’端 突出、３’端突出和平末端。
限制性的内切酶的发现和应用， 才使得人们能在体外有目 的地对遗传物质ＤＮＡ进行改造，从而极大地推动了分子生 物学的兴旺和发展。
第三类（III型）限制性内切酶也有专一的识别顺序，在识别 顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链。但这几个核 苷酸对也不是特异性的。因此，这种限制性内切酶切割后产 生的一定长度DNA片段，具有各种单链末端。因此也不能应 用于基因克隆。
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1. 限制性内切酶的类型
第二类（Ⅱ型）限制性内切酶就是通常指的ＤＮＡ限制性内 切酶.
随着生物技术的发展和科学研究的深入，不断出现具有不 同功能的新载体，如可以容纳几百万碱基的酵母人工染色体
如何构建所需要的载体？
酶切 连接等技术
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一、DNA的限制性酶切实验原理
核酸限制性内切酶是一类能识别双链ＤＮＡ中特定 碱基顺序的核酸水解酶，这些酶都是从原核生物中 发现，功能犹似高等功物免疫系统， 用于抗击外来 ＤＮＡ侵袭。
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粘性末端：是交错切割，结果形成两条单链末端，这 种末端的核苷酸顺序是互补的，可形成氢键，所以称为粘 性末端。
如EcoRI的识别顺序为：
5’…… G|AATTC ……3’
3’…… CTTAA|G …… 5’
在双链上交错切割的位置切割后生成
5’……G
AATTC……3’
3’……CTTAA
功能酶 对称
点下游 24-
26bp
限制作用 是否需用
ATP Yes
No
Yes
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2. 限制性核酸内切酶的命名法
用属名的头一个字母和种名的头两个字母表示寄
主菌的物种名称，如E. coli 用Eco表示，所以用斜
体字。 用一个字母代表菌株或型，如流感嗜血菌
(Heamophilus influenzae)Rd菌株用d，即Hind。
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注意事项——限制性内切酶酶切ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
１．内切酶： 不应混有其它杂蛋白特别是其它内切酶或外切酶的污染； 注意内切酶的识别位点及形成的粘性末端； 内切酶的用量：根据内切酶单位和ＤＮＡ用量而定，通常
1u指在适当条件下，1小时内完全酶解１ug特定ＤＮＡ底物 所需要的限制性内切酶量，使用中一般以１ug DNA对２－ ３u酶短时间为宜。 同时内切酶体积不能超过反应体系１０％，因内切酶中含 ５０％甘油，体系中甘油超过５％会抑制内切酶活力； 内切酶操作应在低温下进行（冰上）；使用时防止操作中 对内切酶的污染。
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
３．反应缓冲液： 反应缓冲液主要由Tris·HCl、NaCl、Mg2+组成，其中Mg2+为 内切酶辅基； Tris·HCl维持反应体系pH值在7.2-7.6之间； NaCl浓度不同形成３种级别的离子强度：
低盐（10mM NaCl) 中盐（50mM NaCl） 高盐（100mM NaCl） 不同的内切酶选择特定的反应缓冲液。
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限制性内 切酶 Ⅰ类 Ⅱ类
Ⅲ类
酶分子 识别位点 切割位点
三亚基双 二分非对 至少在识
功能酶 称
别位点外
1000bp
内 切 酶 与 4-6bp, 大 在 识 别 位
甲基化酶 多数为回 点中或靠
分子不在 一起
文对称结 构
近识别位 点无特异
性
二 亚 基 双 5-7 bp 非 在 识 别 位
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五、注意事项——限制性内切酶酶切
２．ＤＮＡ： 作为内切酶底物，ＤＮＡ应该具备一定的纯度，其溶液中不 能含酚、氯仿、乙醚、SDS、EDTA、高盐浓度、酒精等，这 些因素的存在均不同程度影响限制性内切酶的活力。 这种抑制可通过：
增加酶作用单位数（10~20U/ug DNA）、 增大反应体积以稀释可能的抑制剂 或延长反应时间加以克服。
如果一种特殊的寄主菌株，具有几个不同的限制
与 修 饰 酶 ， 则 以 罗 马 数 字 表 示 ， 如 HindⅠ, HindⅡ，HindⅢ等。
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由 pUC18改造而来，大小为 3162bp 。相当于在 pUC18中增加了带有 M13 噬菌体 DNA 合成的起始与终止以及包装进入噬菌体颗粒所必需的顺式序列。
G……5’
各有一个单链末端，二条单链是互补的，其断裂的磷 酸二酯键以及氢键可通过DNA连接酶的作用而“粘合”。
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平头末端：
II型酶切割方式的另一种是在同一位置上切割双
链，产生平头末端。例如EcoRV 的识别位置是：
5’…… GAT|ATC …… 3’ 3’…… CTA|TAG …… 5’ 切割后形成 5’…… GAT ATC …… 3’ 3’…… CTA TAG …… 5’ 这种末端同样可以通过DNA连接酶连接起来。
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实验十 限制性酶切与连接
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载体（Vectors）
一种能够结合外源DNA 片段形成重组DNA，并能进行自我复制 的DNA 分子称为Vectors
主要载体：质粒、噬菌体以及能在两个不同物种中存在的穿梭质粒。