鼠
骨骨
骺髓
端腔
细 胞 悬 液 约
的
培
养
中
箱 培
养
换 液
消 化 传
次代
取第三代MSCs进行鉴定 CD29、CD44、CD105免疫细胞化学染色
MSCs的标记以及标记物的检测
• 取第3代MSCs，待细胞融合为50%-60% 时，向培养液中加入BrdU (终浓度 5μmol／L)，置37℃、5%CO2孵育箱 内培养
• 每两天换一次液，同时加入新的BrdU 直至MSCs融合
• 免疫细胞化学法行BrdU检测。
无 菌 条雄 件性 下大 取鼠 上的 述触 同须 一部 只皮
肤
D-Hanks Wistar
3-5
3
毛囊的器官培养
液 连 续 冲 洗
遍 ， 每 遍
解 剖 显 微 镜 下 用 眼 科 剪 刀 和
显 微 外 科 器 械 分 离 出 毛 囊
• 倒置显微镜下观察毛囊的生长情况和 MSCs的形态学变化，并测定细胞活力。
MSCs经诱导后细胞表型的变化
分别在诱导后3、7、10、15d用免疫细胞化 学双染色法检测共培养的细胞，观察“毛 囊组”与“对照组”BrdU与K15、BrdU与 K19和BrdU与β1整合素分别共表达的情况， 以PBS代替一抗作阴性对照，DAB显色，在 200倍光学显微镜下观察,细胞膜β1整合素 和细胞质K15、K19免疫组化染色后呈棕黄 色BrdU染核为蓝黑色。“毛囊组”与“对 照组”BrdU与K15、BrdU与K19和BrdU与β1 整合素双染色细胞计数，结果以双染色阳 性细胞百分率表示，比较不同时相细胞 BrdU与K15、BrdU与K19和BrdU与β1整合素 双染色细胞中阳性表达情况。
• 通过比较诱导前后MSCs向毛囊分化过 程中蛋白质表达的变化，国内外未见 报道。
研究计划
• 2005.09—2006.04 综述 • 2006.05—2006.11 开题报告、预
实验 • 2006.12—2007. 7 细胞培养以及相
关指标的检测 • 2007.8-2008.6 总结资料、写论文
MSCs作为首选靶细胞的优点
1. 取材方便，分离培养技术简单。 2. 具有高度增殖的特性，并且体外培
养时，保持了生物学特性的稳定。 3. 体外扩增以及导入外源性基因相对
方便。 4. 可以通过骨髓穿刺取自自体，因而
由它诱导来的组织在进行移植时不 存在组织配型及免疫排斥的问题。
• 已有研究证实MSCs经自体移植作用于 创面局部后，在皮肤微环境中分化为 血管内皮细胞、表皮细胞和皮脂腺导 管细胞。
• 诱导后MSCs的形态。诱导前MSCs呈成纤维 细胞样，诱导后形态发生变化，3天可见细 胞趋向于多角形，随着时间的延长呈现卵 圆形或梭形，到15d时开始出现圆形细胞以 及梭形的集落形成，有一定的增殖分化能 力。
• 4、诱导前、后MSCs免疫细胞化学比较， “毛囊组” MSCsβ1整合素，K15、K19 表 达明显高于“对照组”，统计学处理数据， P<0.01，有显著的统计学意义。
3. 本实验室具备完备的组织培养和显微解剖 的设备，可以完成此项工作。
4. 经费预算: 文献检索:100元 实验动 物:300元 实验药品:2600元 装订论 文:500元 其它:200元 合计:3900元
立题新意
• 通过研究MSCs与毛囊联合培养后的不 同时期MSCs的形态学变化，探讨MSCs 经诱导以后不同时期细胞表型的变化 以及细胞表型转化率如何，国内外未 见报道。
研究目标
1. 观察MSCs与毛囊联合培养后的不同 时期MSCs的形态学变化。
2. 研究MSCs与毛囊联合培养后，MSCs 经诱导以后不同时期细胞表型的变 化及细胞表型的转化率。
3. 研究MSCs与毛囊联合培养后，比较 诱导前后向MSCs毛囊分化过程中相 关表达相关蛋白的变化。
研究内容
1. MSCs的培养、形态学观察以及绘制 生长曲线，MSCs的鉴定及标记
MSCs—组织工程皮肤功能重建的希望
• MSCs体外培养时保持干细胞的特性自 身不断的增殖，在不同的诱导条件下 能够向不同的谱系分化，为重建皮肤 的解剖结构和生理功能带来了希望。
• 因此，研究利用MSCs与毛囊共培养来 诱导MSCs分化来重建毛囊、汗腺、皮 脂腺的生理功能，从而完整重建皮肤 的解剖结构和生理功能，探讨MSCs在 皮肤组织损伤修复过程中的作用及其 机理，为皮肤组织的修复重建开辟新 的思路。
2. 毛囊的器官培养、形态学以及组织 学观察
3. MSCs与毛囊联合培养后，观察MSCs 经诱导后的细胞形态学的变化以及 测定细胞活力
4. 观察MSCs经诱导后细胞表型的变化 及计算细胞转化率
5. 研究MSCs经诱导后向毛囊分化过程 中蛋白质表达的变化
拟解决的关键问题
1. 成功完成MSCs与毛囊联合培养 2. 确定向毛囊、汗腺、皮脂腺定向转
• 因此，MSCs在将来皮肤创伤修复的实 际应用中具有潜在的优势，特别是跨 胚层的分化潜能促使人们探讨能否利 用骨髓间充质干细胞的诱导分化来完 整重建皮肤的解剖结构和生理功能。
MSCs分化的机理和诱导条件
• 大多数人的观点认为MSCs的分化与其所处 的微环境“壁龛”密切相关，不同的组织 细胞微环境有着不同的细胞因子，可能是 诱导MSCs获得靶组织的表型，并向不同细 胞谱系分化的主要原因之一。
目前组织工程皮肤研究的现状
• 虽然组织工程化皮肤是世界上第一种获得 批准的组织工程产品，并在治疗顽固性溃 疡和严重烧伤患者方面取得很好的疗效， 但是迄今未能合成还有皮肤附属器（毛囊、 汗腺、皮脂腺等）的皮肤。
• 目前尚无一种人工皮肤能完全满足创面修 复在功能上的需要，存在一个共同问题是 均不能重建毛囊、汗腺、皮脂腺等皮肤附 属器，降低了皮肤对环境的适应能力，如 何实现皮肤的功能重建成为当前创伤修复 的研究热点。
实验仪器、药品试剂及动物等
• 实验仪器：CO2培养箱、倒置相差显微镜、 超净工作台、显微手术器械和体式显微镜、 压力蒸汽灭菌锅、照相机等。
• 药品以及试剂：DMEM培养基、PBS缓冲液、 D-Hanks液、胎牛血清、胰岛素、氢化可的 松、BrdU以及BrdU抗体、β1整合素和K15、 K19抗体、免疫组化试剂盒、DAB显色剂等。
• 但是近来有人认为以前有关MSCs转化为不 同胚层细胞的现象可能是由于干细胞与所 处的环境中细胞发生融合所致，但是这种 质疑一方面不能解释在体外比较单一的条 件下，诱导MSCs向骨、软骨以及神经等细 胞分化的现象，同时质疑者本身也认为融 合现象发生率比细胞发生转化的发生率更 低，因而不能完全用细胞融合来解释。
骨髓间充质干细胞体外诱导 分化为毛囊的研究
姓名： 导师：* * * 专业：* * *
2006.10.21
立题依据
• 皮肤是人体最大的器官，在抵御微生物入 侵，紫外线辐射以及防止水分的丢失、调 节体温方面起重要作用，同时也是免疫系 统的组成部分之一
• 大面积Ⅲ度烧伤、广泛瘢痕切除、外伤性 皮肤缺损以及皮肤溃疡等导致的严重皮肤 缺损，特别是大面积Ⅲ度烧伤，伤及皮肤 全层及其附属器，因而仅靠创面自身难以 实现皮肤的再生，需要足够的皮肤替代物 进行修复。
• 成功培养毛囊，通过倒置显微镜下观察可发现培 养第1天大部分毛囊开始生长，表现为毛囊逐渐延 长，毛干及内、外根鞘的共同生长，毛囊的生长 延长主要集中在前4天，到第7天后部分毛囊开始 贴壁，可见真皮鞘成纤维样细胞和上皮样细胞从 毛囊的上端或中下端长出，逐渐向周围扩散，呈 铺路石样外观；到第10天以后毛囊大部分贴壁， 生长缓慢，基本无变化。
及细胞活力的检测
化及细胞表型转化率 法检测共培养的细胞
12 2-3d 1
37℃ 5%CO2 10%FCS DMEM 2mL DMEM
100gWistar
MSCs的培养、形态学观察以及鉴
定
剪
取
颈
取去
椎 无出 股
冲 出
、 每
脱 菌股 骨培
的
：
臼 条骨 及养
雄 法 件和 胫液
性 处 下胫 骨冲
大死
骨 的洗
选小 取心 完移 整入 无 损孔 伤培 的养 生板 长中 期， 毛每 囊孔
24
1
分
根
钟
37℃ 5%CO2 0.5ml
在
每
孔 加Βιβλιοθήκη 、入培养
液
孵
育
箱
内
培
养
MSCs与毛囊的联合培养
• 将标记好的MSCs细胞悬液移入24孔培 养板中，每孔0.5ml，然后选取培养 24h后生长明显的毛囊（≥0.1mm）移 入此培养板中，共移入12根，每孔一 根，分成“毛囊组”和“对照组”， （共培养6组，“毛囊组”和“对照 组”各3组），每2-3天换液一次
• 实验动物：Wister雄性大鼠（北京医科大 学实验动物部提供）
本研究的工作基础
本实验室多年从事细胞培养 的研究，并且有研究皮肤组织工 程的基础，具备先进的细胞培养 设备和显微解剖设备，能够顺利 完成相关指标的检测。
化的干细胞类别。 3. 探讨分别将其移植于人造皮肤上构
建含有皮肤附属器（毛囊、汗腺、 皮脂腺等）的人工皮肤。
采取的研究方法、技术路线和实验方案
MSCs的培养、形态学观察以及鉴定
毛囊的器官培养
MSCs的标记以及标记物的检测 选取生长明显的毛囊（24h≥0.1mm）
MSCs与毛囊的联合培养
MSCs细胞形态学的变化 MSCs细胞表型的变 免疫细胞化学双染色
组织工程皮肤功能修复的希望
• 随着干细胞理论技术的发展，给重建皮肤 创伤组织解剖结构的同时恢复其生理功能 带来希望。
• 干细胞分为胚胎干细胞和成体干细胞，胚 胎干细胞由于涉及伦理学的问题，目前大 规模的基础研究和临床应用受到一定限制， 因此成体干细胞的研究备受重视。