微生物生理学实验―――铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定目录实验〇铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理实验一细菌总DNA的提取与检测实验二铜绿假单胞菌fabI基因PCR扩增实验三铜绿假单胞菌pafabI基因表达载体构建实验四质粒的提取与检测实验五大肠杆菌感受态细胞的制备及DNA转化实验六遗传互补大肠杆菌fabI温度敏感突变菌株实验七铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶的原核表达实验八铜绿假单胞菌烯酯酰ACP还原酶纯化实验九体外鉴定烯酯酰ACP还原酶的酶活性实验十构建铜绿假单胞菌fabI突变菌株实验十一菌落PCR筛选重组子实验十二铜绿假单胞菌脂肪酸合成分析实验报告实验〇铜绿假单胞菌fabI基因鉴定的原理脂肪酸的生物合成是一种细胞生物体重要的基础代谢。

生物体脂肪酸合成系统（FAS）为磷脂和类脂等生物质膜组分提供重要的前体物质，同时生物体内一些重要的化合物如硫辛酸、生物素以及细菌群体感应的信号分子等也都需要以脂肪酸合成代谢中的中间产物为前体物质合成。

在不同生物体内，脂肪酸的生物合成过程的基本原理是相似的，但是催化反应的蛋白序列和结构则有着很大的差异。

根据合成酶系统的这种差异，人们将脂肪酸生物合成系统分为I型脂肪酸合成酶系（FASI）和II型脂肪酸合成酶系（FAS II）(Cronan, 2006)。

I型脂肪酸合成酶系主要分布在哺乳动物和真菌等生物中，该种脂肪酸合成由一个（或两个）分子量较大的多功能酶蛋白催化。

这种多功能酶蛋白有多个不同功能的结构域，脂肪酸延伸循环中的各个反应分别在酶蛋白的不同结构域进行(Heath et al, 2002a; White et al, 2005)。

II型脂肪酸合成酶系主要分布在细菌，植物和原生动物中，该类生物的脂肪酸合成由一组独立存在的酶催化完成，该系统中各个独立的酶蛋白分别行使一种功能(Cronan, 2006; White et al, 2005)。

细菌脂肪酸的合成过程中，酰基链通过硫脂键连接在酰基载体蛋白（ACP）上。

ACP是一种小分子量蛋白，一般由70-80个氨基酸残基组成，是FAS II的核心成员之一。

以大肠杆菌为例，说明脂肪酸合成的路径。

1. 脂肪酸合成的起始：脂肪酸合成的起始反应是以细菌体内的乙酰辅酶A合成起初的四碳的短链脂肪酸的过程，该四碳的短链脂肪酸（acyl-CoA）及CO2产物是酰基链延长反应的基础(Revill et al, 2001; White et al, 2005)。

此过程通过羧化、转移、缩合三步来完成：第一步，羧化：乙酰CoA在乙酰辅酶A 羧化酶（ACC）作用下转化为丙二酸单酰辅酶A（Mal-CoA）。

ACC有4个独立的蛋白构成（AccA，AccB，AccC，AccD），其中AccB的行使功能需要生物素作为共价结合的辅因子(Cronan et al, 2002)。

第二步，转移：Mal-CoA在丙二酰转酰基酶（FabD）的作用下将丙二酸单酰基团转移至ACP上，形成Mal –ACP(Jackowski et al, 1987)。

第三步，缩合：在β酮脂酰ACP合成酶III（KAS III，FabH）的作用下将乙酰CoA所携带的酰基链合缩合到Mal-ACP上，生成β酮丁酰ACP，起始新的酰基链的生成(Revill et al, 2001)。

图1 大肠杆菌脂肪酸合成途径2. 酰基链的延长：FASII中有四种关键酶行使碳链延长的功能，该延长过程是以循环的形式进行，每次循环都经过缩合、还原、脱水、再还原四个步骤，使脂肪酸碳链延长两个碳原子(White et al, 2005; Zhang et al, 2008a)。

第一步，缩合：碳链的延长是由β酮脂酰ACP合成酶（-ketoactyl-ACP synthetase，KAS）来催化完成的。

延伸反应中β酮脂酰ACP合成酶有KAS I （FabB）和KAS II （FabF）两种。

每次缩合反应，碳链延长两个C原子，同时在酰基链的β位引入一个酮基(Bergler et al, 1992; D'Agnolo et al, 1975)。

第二步，还原： KAS在延长碳链的同时引入了β位酮基，该基团在β酮酯酰ACP还原酶（-ketoactyl-ACP reductase，KAR，FabG）的作用下加氢还原，转化为羟基集团，将β酮酯酰ACP转化成为β羟酯酰ACP，同时将还原剂NADPH 氧化(Price et al, 2001;2004)。

第三步，脱水：β羟酯酰ACP脱水形成反2稀酯酰ACP为一可逆反应。

该过程由不同底物专一性的两种β羟酯酰ACP脱水酶（-hydroxydecanoyl-ACP dehydratase，HAD）：FabZ和FabA催化完成(Iram et al, 2005; Mohan et al, 1994)。

第四步，再还原：循环反应的最后一步由烯酯酰ACP还原酶(FabI) (enoyl-ACP reductase，ENR)来催化完成，将反2烯酯酰ACP还原为饱和酯酰ACP，同时消耗辅因子NADH (Heath et al, 1995; Heathet al, 2002b; Massengo-Tiasse et al, 2008)。

各种细菌间FAS的成分不同，最终的脂肪酸酰基链的长度也有所不同。

一般延伸到16-18个碳原子的链长的脂酰ACP时，碳链停止延长，作为磷脂合成的前体物质被利用(Zhang et al, 2008a;b)。

铜绿色假单胞菌（pseudomonas aeruginosa），医学上称绿脓杆菌，是假单胞菌属（pseudomonas）中极为重要的一个种。

该菌是革蓝氏阴性细菌，杆状，广泛分布于自然界及正常人皮肤、肠道和呼吸道，是临床上较常见的条件致病菌之一。

本实验的目的就是搞清楚铜绿假单胞菌是否有fabI同源基因，若有PafabI 的功能怎样？是否与大肠杆菌的FabI的功能相同抑或有一些相异的功能。

因此我们将本次微生物生理实验的课程名定为铜绿假单胞菌fabI基因的克隆及功能鉴定。

2000年，铜绿假单胞菌PAO1菌株全基因组测序完成，并由61位科学家组成的科研小组完成了其基因组的注释工作。

PAO1菌株基因组全长6,264,403bp包含有5565个基因或者假想基因。

铜绿假单胞菌基因组测序及注释工作的完成，为研究铜绿假单胞菌脂肪酸合成路径提供了方便。

我们可以根据同源序列法克隆目标基因。

目前，世界上主要的基因库有:(1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。

目前,以Genbank的应用最频繁。

这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。

从上述数据库中查询所要研究的目标蛋白或基因，然后从中获得基因的全长序列。

根据整个基因序列设计特异的引物，通过PCR 从基因组中克隆该基因。

实验一细菌总DNA的提取与检测一、实验器材铜绿假单胞菌PAO1；WTL缓冲液；PCP缓冲液；异丙醇；70%的乙醇；RNase A；1.5 ml离心管；各种枪头；移液器；水浴锅；高速台式离心机；旋转蒸发仪；琼脂糖凝胶电泳系统；紫外分光光度计。

二、目的要求(1)了解常用的细菌总DNA制备方法的原理和适用范围。

(2)学习细菌总DNA的操作技术。

三、基本原理细菌基因组的大小一般为1-5 Mb。

制备纯的质量高的总DNA是进行细菌基因组分析、基因克隆和遗传转化研究等的基础。

细菌总DNA的制备方法很多，但大都包括两个主要步骤：先裂解细胞，接着采用化学或酶学方法除去样品中的蛋白质、RNA、多糖等大分子，本实验采用Omega公司的SQ Tissue DNA Kit方法简化了提总DNA的步骤，样品首先用WTL缓冲液裂解细胞，用PCP缓冲液使蛋白质沉淀下来，而总DNA存留在上清液中，然后用异丙醇沉淀得到高质量的细菌总DNA。

四、操作步骤(1)细菌总DNA的提取（按Omega的Bacterial DNA Kit方法）1. 用1.5 ml离心管收集1.0 ml过夜培养的铜绿假单胞菌PAO1菌液10,000 rpm 室温离心1 min，每个组收集两管进行后面的操作；2. 去上清液，加入180 μl TE 溶液，充分悬浮细胞后，加入20 uL IS溶液，室温保存10 min；3. 5,000 rpm 离心5min，去上清，加入200 uL BTL溶液充分悬浮细胞；（可选择步骤：对于G+细菌，加入30 uLGP溶液，剧烈震荡5min；将上清转移至另一个离心管。

）将样品于55°C水浴60 min使细胞裂解完全。

4. 加入25μL蛋白酶K，充分混匀，将样品置于55°C水浴60 min，没10 min 颠倒混匀一次，使细胞裂解完全。

5. 加入5μL RNase A 颠倒数次混匀，室温静置20min，（可选择步骤：10,000rpm离心5min，转移上清至另一个干净离心管）6. 加入220 uL BDL溶液，充分混匀，65°C水浴10 min，加入220uL无水乙醇，充分混匀，如果有沉淀，吹打去除沉淀。

7. 将上清转移至吸附柱中，10,000rpm离心离心1min，去承接液；8. 加入500μL HB溶液，10000rpm离心离心1min，去承接液；9. 加入500μL WB溶液，10000rpm离心离心1min，去承接液；10. 重复步骤9一次11. 12000rpm离心2min12. 将吸附柱转移至一个新的1.5mL离心管中，加入100μL EB溶液，静置3min13. 10000rpm离心1min，收集洗脱液。

(2)琼脂糖凝胶电泳检测总DNA1. 清洗并安装好的制胶槽，插入适当的梳子。

2. 称取0.5 g琼脂糖于三角瓶中，加入50 ml 0.5 × T BE电泳缓冲液，称量三角瓶总重量。

摇匀后放在微波炉上加热并且不断摇动，至琼脂糖完全溶解，加水补足原重。

待冷却到约50°C后（不烫手为宜），加4 μl GoldView，摇匀后倒入摆好的18孔制胶板中冷却凝固，1 h以后使用。

3. 凝固后垂直向上拔出梳子。

连同制胶板一同取出凝胶，清理制胶板下侧和制胶槽内的碎胶，放入已装有0.5× T BE电泳缓冲液的电泳槽中，以浸过胶面5 mm 为宜。

4. 用移液器吸取适量DNA样品，1 μl 10 x loading buffer在点样板上混匀后点样，记好各组的点样孔位置。