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印迹杂交过程
⒈ 样品制备→⒉ 电泳分离→⒊ 印迹→⒋ 预杂交→ ⒌ 杂交→⒍ 洗膜→⒎ 分析
固相支持物
• • • • 电泳用的凝胶不能直接做支持物 将核酸分子结合于表面 有较好的机械强度 常用硝酸纤维膜和尼龙膜
几种转膜方法：
（1）毛细管虹吸转移法
吸水纸 NC膜或尼龙膜 滤纸 转移缓冲液 玻璃板 重物（500g）
滤纸
凝胶
支持物
上行毛细管转移
（2）电转移
①一般用尼龙膜作电转移的载体（NC膜不行） ②单链DNA和RNA可进行转移，双链DNA先在原位进行碱 变性，随后中和，再转移 ③特点：转移快，2-3小时即可；
（3）真空转移
使用真空转移装置，较毛细管转移更为有效，快捷。
电转移法
真空转移法
预杂交
• 固相膜可结合DNA，包括探针。 • 封闭固相膜上多余的结合位点。 • 常用非特异性的DNA或蛋白质。
微量点样法 原位合成法
探针设计与制备 支持物预处理
探针打印
探针固化 DNA芯片 杂 交 与 漂 洗 扫 描 与 分 析
显微光蚀刻/压电打印/分子印章
样品准备
核酸提纯
扩增与标记
标记核酸纯化
① 基因芯片制备
就是根据实验目的和要求，将设计好的检测探针， 通过一定的方法固定到固相支持物上。
主要有两种：原位合成法和直接点样法
影响杂交的因素
• • • • • 杂交温度， 离子强度 DNA和探针浓度 杂交促进剂，聚乙二醇 杂交时间
常用核酸杂交分类 杂交方法
Southern印迹
适用范围
检测经凝胶电泳分开的DNA分子, 需转印到膜上 检测经凝胶电泳分开的RNA分子, 需转移到膜上 检测未经分离的,固定在膜上的 DNA或RNA分子 检测固定在膜上的,经裂解后从细菌和 噬菌体中释放的DNA分子
四、菌落杂交法和噬菌斑杂交法 操作： NC膜拓印培养的菌落 原位裂解菌落，释放DNA 预杂交 杂交 结果分析 从原培养皿筛选含目的DNA的阳性菌落
用途：筛选含有特异DNA序列的阳性菌落 或噬菌斑
菌落杂交
检测重组体克隆的菌落杂交技术
菌 落 杂 交
五、核酸原位杂交（组织原位杂交） 概念：在细胞或组织切片中进行核酸杂交并 对其实行检测的方法，称为核酸原位 杂交（nucleic acid hybridization in situ) 用途：研究核酸序列在染色体中的精确定位； 研究细胞特定基因表达水平；确定组织 有无病原体感染等。
DNA限制片段
（b）
（ c）
（d）
硝酸纤维素滤膜
同探针同源杂交的 基因DNA片段 X光底片
（ e）
DNA印迹杂交的主要步骤
• • • • 待测DNA样品的制备、酶切 待测DNA 样品的电泳分离：琼脂糖凝胶电泳 凝胶中DNA的变性：碱变性 印迹（转膜）： – 硝酸纤维素(NC)膜、尼龙膜 – 毛细管虹吸印迹法、电转印法、真空转移法 预杂交（封闭） 探针的制备 固相膜上杂交（控制温度） 洗膜：除去游离的探针 杂交信号的检测
(双向电泳蛋白质印迹技术)
Southern blotting 用于分析DNA
核酸分子杂交基本原理
• 核酸分子杂交是指来源不同、具有互补序列 的两条核酸单链在一定条件下按碱基互补配 对原则形成双链的过程。 （固相和液相杂交）
变性
复性







探针(probe)
杂交的一方是待测核酸序列，另一方是已知核酸序 列，通常把已知的核酸序列称作探针（probe）。 • 探针(probe)，是指与待测的分子发生特异性相互 作用，并可被特殊的方法探知的分子。 • 除了核酸探针外，探针利用抗体-抗原、生物素抗生物素蛋白、生长因子-受体的相互作用的原理 与靶分子结合。
核酸探针应具有的条件： • 带有标记物； • 单链； • 高度特异性； • 检测方法应简单，灵敏度；
核酸探针的种类
• • • • 基因组DNA探针 cDNA探针 RNA探针 寡核苷酸探针
核酸探针标记物 分为放射性标记探针和非放射性标记探针两 大类
1、放射性同位素 应用广泛，以32P应用最普遍，放射自显影。 优点：灵敏度高； 缺点：放射性污染，半衰期短、不稳定等。
免疫印迹（Western blotting)
将待测蛋白质 （抗原）变性
电泳
转移到 NC膜上
封闭
加入 抗体
加入标记 的二体
显示 区带
检测
检测分析
应用举例
• 基因芯片与中医寒证的7类相关基因 对典型寒证而且用热药有明显疗效者， 尝试用基因芯片筛选出59条差异表达基因 表达谱（涉及到7类基因），探索寒证所涉 及的相关基因类别。
原位合成法和直接点样法的比较
② 样品制备
——与一般的核酸提取比较类似，只不过为了降低污 染和提高检测灵敏度增加了纯化、扩增（PCR）和标记。
常用标记物： 生物素 荧光素 对照样品（Cy5-dUTP） 待测样品（用Cy3-dUTP 标记）
待测样品用 Cy3，发射 562nm红色 荧光
• 方法： 精选对其治疗有明显疗效的典型寒证 病例，在治疗前后分别采外周血，提取血 液中的mRNA，再逆转录为cDNA以备检 测。采用2035条人的靶基因cDNA制备成 基因表达谱芯片。用两种荧光物质分别标 记治疗前与治疗后cDNA，用其制备成探 针与表达谱芯片进行杂交。
结果：
初步筛选出了差异表达基因59条，涉 及到与能量代谢、糖代谢、脂记的
3’ 5’ 切口原始位置
切口最终位置
32P标记的DNA
单链DNA片段
DNA切口平移标记法
随机引物法（random
priming )
随机寡核苷酸引物（random primer)： 含有各种可能排列顺序的寡核苷酸片段 的混合物，可以与任意核苷酸序列杂交， 起到聚合酶反应引物的作用 • E.coli DNA聚合酶I的Klenow大片段（仅具 有5-3多聚酶的活性，而无外切酶的活性）
末端标记法
• DNA末端末端标记法只是将DNA片段的一 端（5’端或3’端）进行部分标记。由于标记 活性不高，标记物掺入率低，一般极少用 做核酸分子杂交探针标记。
末端标记法
探针的纯化
• 目的：除去游离的标记dNTP • 方法：乙醇沉淀、凝胶过滤
核酸印迹杂交技术原理和流程
（a）
基因组DNA
技术过程
1 2
支持物
NC或尼龙膜
与探针同源杂交的 基因DNA片段
放 射 自 显 影 照 片
二、RNA印迹法（Northern bloting）
操作：与DNA印迹相似 RNA经变性后再电泳， 凝胶中加甲醛保持RNA单链。
用途：检测mRNA、检测基因表达情况
Northern印迹杂交
• 是一项用于检测特异性RNA的技术。
原位杂交
蛋白质印迹法
• Western 印迹法（Western bloting）分析 蛋白质的化学基础是其免疫原性，又称为 免疫印迹法或酶联免疫电转移印斑法 • 用途： 鉴定一个蛋白质样品中的目的蛋白，检 测一目的蛋白在不同组织细胞的相对含量。
• 典型的印迹过程包括三个步骤 ①蛋白质的电泳分离； ②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜 上，用非特异性，非反应活性分子封闭固 体膜上未吸附蛋白质区域； ③免疫学检测。
DNA凝 胶电泳
blotting
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
变性
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Southern印迹杂交法
内切酶
基因组DNA
重物 纸巾 10×SSC 转移缓冲液 500g
1 2 M
DNA酶切片段
玻璃板 Whatman滤纸 NC膜或尼龙膜 凝胶 Whatman滤纸
5’ 3’ 变性 3’ 随机引物 3’ Klenow片段α-32P-dNTP 3’
3’ 5’ 双链DNA
5’ 单链DNA 5’
5’
变性
32P标记的单链
DNA探针
DNA的随机引物标记法
PCR标记法
• 在PCR反应底物中，将一种dNTP换成标记物标
记的dNTP，这样标记的dNTP就可在PCR反应的 同时掺入到新合成的DNA链上。
2、非放射性标记物
生物素：
一种小分子水溶性维生素，
连接在碱基上，
和抗生物素蛋白（avidin）特异结合， 抗生物素蛋白上连接有显色物质(酶、荧光素等) 。 地高辛： 一种类固醇半抗原分子， 可利用其抗体进行免疫检测， 原理类似于生物素的检测。
核酸探针的制备
• 常将标记物连接到某种脱氧核糖核苷三磷 酸(dNTP)上，然后可通过切口平移法、随 机引物法、PCR标记法、末端标记法等方法 标记探针
Northern印迹
斑点杂交
菌落杂交和噬斑杂交
原位杂交
检测细胞或组织中的DNA或RNA分子
一、DNA印迹法（Southern bloting ） 将电泳分离的待测DNA片段转移并结 合到一定的固相支持物上，然后用标记的 DNA探针检测待测DNA的一种方法。 用途：检测目的DNA的存在，基因突变
Southern
RNA凝 胶电泳
毛细管作用 使DNA单链转 电转移
真空吸引
移到硝酸纤维 素膜（NC） 显出杂 交区带
与探针进 行杂交
放射自 显影
Northern Blot
β-1，4糖基转移酶在损伤坐骨神经中的表达(Northern
杂交)
三、斑点印迹 操作：不做电泳分离，将DNA、RNA样品 变性后点在干的NC上，与探针杂交。 用途：检测DNA样品同源性、细胞内特 定基因拷贝数；mRNA的相对含 量。