实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）实践目的：
1．掌握血凝（HA）和血凝抑制(HI)试验的原理
2．掌握鸡新城疫病毒血凝和血凝抑制试验的操作方法
实践原理：
某些病毒(如鸡新城疫病毒，禽流感病毒等)能够与人或动物的红细胞发生凝集，此即为
病毒稀释倍数1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 1:64 1:128 1:256 1:512 1:1024 1:2048 对照生理盐水
病毒液
1％红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl
# 表示100％完全凝集++ 表示50％凝集- 表示不凝集
表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能使100％红细胞凝集的病毒液的最高稀释倍数，称为该病毒液的红细胞凝集效价。
如上例：病毒液的HA效价为1:128，HI试验时，病毒抗原液25微升内须含4个凝集单位，则应将原病毒液作成128/4＝32倍的稀释液。
生理盐水225µl
被检血清
4单位病毒液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放37℃作用20分钟
1%红细胞悬液25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl25µl 振荡器上振荡1～2分钟，放137℃作用15分钟
结果例示-------++##-#注：- 表示不凝集、++ 表示部分凝集、# 表示完全凝集。
淀，表明红细胞未被或不完全被病毒凝集；如果孔底的红细胞铺平孔底，凝成均匀薄层，倾斜后红细胞不流动，说明红细胞被病毒所凝集。
能将4单位病毒物质凝集红细胞的作用完全抑制的血清最高稀释倍数，称为该血清的红细胞凝集抑制效价，用被检血清的稀释倍数或以2为底的对数(10g2)表示。
如上例，该血清的红细胞凝集抑制效价为1：128或HI效价为7(10g2)。
2．根据血凝价将新城疫病毒稀释成4个单位病毒液，每三位学生做一个血凝抑制试验，检测待检血清的血凝抑制效价，记录试验结果
3．回答问题：
（1）病毒的血凝和血凝抑制试验的原理是什么？
（2）病毒血凝反应是抗原抗体反应吗，为什么？
（3）病毒血凝抑制反应是抗原抗体反应吗，为什么？
实践三病毒血凝和血凝抑制试验--（以新城疫为例）
（一）实践目的：
1、掌握血凝及血凝抑制试验的基本方法及原理
2、掌握鸡新城疫的试验室诊断技术。
（二）实践内容与基本要求：
实践原理：某些病毒，如鸡新城疫、禽减蛋综合症等，有能凝集动物红细胞的特性，此即红细胞凝集现象。
这些病毒囊膜上有糖蛋白血凝素，能与动物的红细胞表面的糖蛋白受体结合，发生红细胞凝集现象。
可以利用这一特性判断被检材料中有无病毒的存在，并可以测定病毒的效价。
1、血凝试验：常多用感染鸡胚液进行，凝集价可达1:160---1:640也可采用急性病例的组
操
型、
）
倍
采血法：先用三棱针刺破翅下静脉，随即用塑料管引流血液至6~8cm长。
将管一端烧融封口，待凝固析出血清后以1000r/min离心5分钟，剪断塑料管，将血清倒入一块塑料板小孔中，若需较长时间保存，可在离心后将凝血块一端剪去，滴融化石蜡封口，于0o C保存。
（四）实践方法
操作方法
4.1 微量血凝试验
4.1.1 于微量血凝板的每孔中滴加磷酸缓冲盐稀释液50ul，共滴四排。
4.1.2 吸取1:5稀释抗原滴加于第一列孔，每孔50ul，然后由左至右顺序倍比稀释至第11列孔，再从第11孔各吸取50ul弃之。
最后一列不加抗原作对照。
4.1.3 于每孔加入0.5%红细胞悬液50ul。
4.1.4 置微型振荡器上振荡1分钟，或手持血凝板绕圆圈混匀。
4.1.5 放室温下（18~20oC）30~40分钟，根据血凝图象判定结果。
以出现完全凝集的抗原最大稀释度为该抗原的血凝滴度。
每次四排重复，以几何平均值表示结果。
4.1.6 计算出含4个血凝单位的抗原浓度，按式（B1）进行计算。
抗原应稀释倍数=血凝滴度/4……………………..(B1)
上述材料全部按顺序加完后，振荡96孔板，使红细胞与病毒充分接触，然后置于20-22℃室温中静置，自第15分钟开始观察结果，每5分钟检查一次，至60分钟结束，观察结果时注意不要摇震96孔板。
如果被检材料中有病毒的存在，就会出现红细胞的凝集现象，红细胞出现凝集反应者,凝集成片或碎片,呈伞状铺于管底,不凝集的红细胞沉积于管底,呈一小圆点,将板倾斜,可以看到沉积于底板上的红细胞沿倾斜面呈线状流动.
（五）结果观察：
1．首先观察对照孔，红细胞应无凝集。
2．观察实验孔
++++全部红细胞凝集，凝集的红细胞铺满管底，边缘不整齐，无红细胞沉积。
+++ 大部分红细胞凝集，在管底铺成薄膜状，但尚有少数红细胞不凝，在管底中心形成小红点。
++ 约有半数红细胞凝集，在管底铺成薄膜，面积较小，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆点。
+只有少数红细胞凝集，不凝集的红细胞在管底中心聚成小圆盘状，凝集的红细胞在此小圆盘周围。
-不凝集，红细胞沉于管底，成一致密圆盘，边缘整齐。
病毒血凝呈现的不同程度凝集强度
凝集效价：能使红细胞呈++凝集的病毒最高稀释度为凝集效价，表示含有一个单位血凝抗原。
如上述第7孔为++，则该病毒悬液效价为1：128，即病毒稀释到1：128时，每50μl 中含一个血凝单位的病毒。
凝集孔数越高,病毒凝集效价越高.
4单位病毒：血凝试验（HA）测出病毒的HA价，配制成4单位病毒，装于疫苗瓶中冷冻备用。
病毒的血凝实验（HA）结果分析
（五）鸡新城疫微量血凝抑制试验
5.2.1 先取稀释液50ul，加入微量血凝板的第一孔，再取浓度为4个血凝单位的抗原依次加入3~12孔，每孔50ul，第二孔加浓度为8个血凝单位的抗原50ul。
5.2.2吸被检血清50ul 于第1孔(血清对照)中,挤压混匀后吸50ul 于第2孔,依次倍比稀释至12孔,最后弃去50 ul.
5.2.3置室温(18—20℃)下作用20分钟.
5.2.4滴加50ul 0.5%红细胞悬液于各孔中,振荡混合后,室温下静置30—40分钟,判定结果5.2.5每次测定应设已知滴度的标准阳性血清对照.
结果判定
1在对照出现正确结果的情况下,以完全抑制红细胞凝集的最大稀释度为该血清的血凝抑制滴度.
2若有10%以上的鸡出现11(log2)以上的高血凝抑制滴度,说明鸡群已受新城疫强毒感染.
3若监测鸡群的免疫水平,则血凝抑制滴度在4(log2 )的鸡群保护率为50%左右;在4(log2)以下的保护率达90%--100%;在4(log2)以下的非免疫鸡群保护率约为9%,免疫过的鸡群约为43%.鸡群的血凝抑制滴度以抽检样品的血凝抑制滴度的几何平均值表示,如平均水平在
4(log2 )以上,表示该鸡群为免疫鸡群.
（六）实践要点
1.配置1%红细胞悬液时不能用力摇震，以免把红细胞膜震破，造成溶血，影响实验效果。
2.在滴加材料时，注意每滴加一种材料更换一个滴头，以免病毒与红细胞混合影响实验效果。
3.稀释病毒时将材料充分混匀后再吸出滴入下一孔中。
4.适时观察结果，如果长时间放置，凝集的红细胞团会沉降下来，造成观察结果不准确。
（七）作业
1.报告血凝试验（HA）的血凝效价的判定结果。
2.病毒的血凝和血凝集抑制试验试验有何意义?。