PCR引物设计
辅助软件：DNASIS
•回顾PCR原理
PCR的六大要素
• • • • • • 引物 DNA聚合酶 dNTPs 模板 缓冲液 Mg2+
DNA的表示方法
DNA有方向性，5’-------3‘ 大肠杆菌基因组大小：460万碱基对(bp)
基因的表示方法
• CDS:complement(4189888..4190658)‘板书 • CDS: (4189888..4190658)
原则4
预测引物自身的二级结构，3‘末端必须游离
在DNA聚合酶和dNTP存在的情况下，引物以自身为模 板，沿着3‘末端延伸
允许
允许
原则5
正反向引物之间不能互补配对
正向引物与正向引物也不能互补配对
反向引物与反向引物也不能互补配对
如何检查正反向互补配对
• 取正向引物的3’末端的四个碱基，反向互补 后，在正反向引物中查找 • 若查找得到说明有互补配对的情况存在， 引物要重新设计(删减或增加3’碱基数量）
基因是有方向性的，有时在这条链上，而有时在反向互补链上
起始密码子atg,编码甲硫氨酸
终止密码子：taa,tag,tga,不编码氨基酸
引物设计软件介绍
• DNASIS的功能：
• • • • 1.获得反向互补序列 2.搜索限制性内切酶位点 3.翻译情况 4.预测二级结构
• 引物：
• 要扩增模板DNA，首先要设计两条寡核 苷酸引物,实际上就是两段与待扩增靶DNA 序列互补的寡核苷酸片段，两引物间距离 决定扩增片段的长度，两引物的5’端决定扩 增产物的两个5’末端位置。由于引物是决定 PCR扩增片段长度、位置和结果的关键， 因此，引物设计也就更为重要。
Tm值的计算
• 每个引物都有Tm1和Tm2, • Tm1取与模板匹配的序列，A、T算2℃，G 、 C算4 ℃ • Tm2取引物的全长序列，A、T算2℃，G 、 C算4 ℃
正反向引物的Tm值尽量接近--------原则6
优先满足前五个原则
PCR的退火温度一般取Tm-（5～10 ℃）
实战演练
原则1
• 正向引物序列选用目的DNA片段的上游序 列，也就是atg开始那一段
原则2
引物的长度16-30bp(与模板匹配部分）
原则3
5’末端可以添加不与模板匹配的序列，比如 限制性内切酶位点和保护性碱基
常用的限制性内切酶：BamHI:ggatcc HindIII:aagctt NdeI:catatg NcoI:ccatgg 通常具有回文结构 为什么要加保护性碱基呢？（在DNA内部切割，提供内切环境）