实用文档
8
吸附层析
常用的吸附剂
硅胶
氧化铝
碱性:碳氢化合物 中性:醛,酮,醌,酯,内酯 酸性:酸性色素,醛,酸
活性炭
粉末:吸附力大,流速慢 颗粒:吸附力中,流速易控 锦纶-活性炭:吸附力弱
聚酰胺
锦纶66或锦纶6 酰胺基团 对酚,DNP-氨基酸, 醌,羧 酸 氢键：羟基与羰基
磷酸钙
唯一用于生物活性物质 羟基磷灰石
二、亲和层析分离
1、装柱和平衡 2、上样、亲和吸附 3、洗脱
无效洗脱
吸附效率不高 实用文档
有效吸附 55
洗脱方法
（1）非特异性洗脱：改变
洗脱液pH值
离子强度
梯度洗脱
（2）特殊洗脱：当蛋白吸附紧密或上述方法洗脱 会引起失活，可用专一的化学方法裂解配基与载体 的连接键，再用透析或凝胶层析法去除配基。
组分在凝胶柱
中的迁移速度
不同得到分离。 小分子 被延滯
较快流出
实用文档
19
实用文档
20
凝胶层析过程的数理关系
1、柱床体积(VT) 2、洗脱体积（Ve） 即欲分离物质通过层析柱洗脱下来所需洗脱
液的总体积。 3、外水体积（V0） 4、内水体积（Vi） 5、凝胶干体积（Vg）
实用文档
21
数理关系
外水体积V0
43
固相化 再生
样品
实用文档
44
实用文档
45
实用文档
46
常见具有专一性亲和力的生物分子对：
酶：
基质类似物，抑制剂，辅酶
抗体：
抗原，病毒，细胞
细胞：
细胞表面特异蛋白，外源凝集素
核酸：
互补碱基序列，组蛋白，核酸聚合酶，
结合 蛋白
激素或药物：受体，载体蛋白
外源凝集素：多糖，糖蛋白，细胞表面受体，细胞
蛋白质分离技术-层析
上海交通大学医学院 倪培华 副教授
实用文档
1
一、概述
1、定义 层析(又名色谱)
一种利用混合 物中各组分的物理化 学性质间的差异，使 各组分在层析两相中 以不同程度分配，借 此将各组分分离。
实用文档
2
2、物理化学性质间的差异
分子极性 分子大小 分子形状 离子亲和力 分子亲和力 吸附能力
E0、L0：起始浓度
当L0》E0时
KL =[E0-EL][L0]/[EL]
[EL]=[E0-EL][L0]/ KL
Kd=结合酶/游离酶=[EL]/[E0-EL]=[L0]/ KL
实用文档
53
（三）固相化——将配体以共价键连接于固相基 质上制成固相化吸附剂
载体的排斥效应 载体的空间障碍
实用文档
54
每个溶质分子在流动相和固定相之间有一 个特定的分配系数（Kd）
Ve=Vo+KdVi
Ve -Vo — Kd = ———
Vi
特点： （1）与被分离物质分 子的大小和凝胶颗粒 孔隙的大小有关 （2）与柱的长短粗细 无关
实用文档
23
(1)Ve = Vo (2)Ve = Vo + Vi
Kd = 0
Kd = 1
实用文档
35
二、操作注意点：
1、装柱 ※先用蒸馏水赶走层析柱中的死体积； ※凝胶不能有气泡和分层现象； ※装柱结束后要保持凝胶表面平整。
实用文档
36
2、加样 ※使液面和凝胶表面相切，关闭出口； ※加样时尽量不要破坏凝胶面； ※让样品进入凝胶以后在加蒸馏水开始洗脱。
实用文档
37
三、结果要求：
血红蛋白和二硝基苯-鱼精蛋白的 洗脱体积？ 柱的外水体积和内水体积
Albumin
NaCl
Elution volume (ml)
实用文档
32
测分子量
Ve
log Mr
实用文档
33
实验： 凝胶层析法分离蛋白质
实用文档
34
一、原理：
血红蛋白
64,480
二硝基苯-鱼精蛋白
2,000-12,000
Sephadex G-50 孔径 1,500-30,000
Kd=0 Kd=1
纯化生物物质的纯度
取决于混合物中各组分K 值的差异 程度。
混合物中各组分若 K值相差较大, 则能较易地把混合物中的生物物质分 离。反之,K值相差较小,不易把混合物 中的生物物质分离。
实用文档
15
凝胶层析 Gel Chromatography
凝胶过滤 （gel filtration）(Porath, Flodin, 1959)
凝胶层析
离子交换层析 亲和层析
吸附层析
实用文档
3
3、层析的发展
➢ 1903年 俄国植物学家 茨维特 发表了有关填充以菊根粉的玻璃柱分离植物 色素，以石油醚冲洗，得到黄色、绿色区带;
➢ 1970s早期 高效液相色谱法（HPLC)
➢ 目前 气相层析仪和HPLC与色谱、质谱以及计算 机联用。
实用文档
4
层析法进行时有两个相，一个 相称为固定相，另一相称为流动相。
实用文档
38
亲和层析 Affinity
Chromatography
Ni Peihua
实用文档
39
一、原理
亲和层析是利用生物大分子所具有的专 一亲和力而设计的纯化技术。
寻找配基 使配基固定化 制成亲和层析柱
实用文档
40
基本过程 •固相化
+
实用文档
41
吸附
+
+
洗
脱
实用文档
42
解吸
+
实用文档
3.聚丙烯酰胺凝胶
实用文档
29
Pharmacia
Sephadex glucose
■ 各
Sepharose agarose Sephacryl glucose + acrylamide
种
Sephacel cellulose
层
析
胶 体
Bio-Rad
：
BioGel P acrylamide
BioGel A agarose
实用文档
9
（2）分配层析
——利用不同组分在流动相和固定相中的分配 系数不同而进行分离的方法。
实用文档
10
3.按制备量分类
柱层析 进样量大且容易回收
薄层层析 小量样品，快速， 操作简便
实用文档
11
■ 层析法的演变过程：
圆形滤纸
长条滤纸
加展开液
柱层析
薄层层析 (TLC)
实用文档
容量变大
容量更大
1.凝胶是一种不带电 荷的惰性载体，结 构稳定。
2. 操作条件较温和 。
3. 样 品 得 率 高 , 重 复 性好,可进行大量样 品的分离纯化。
四、凝胶层析的缺点 1.要求样品和洗脱液的
粘度很低。
2.凝胶颗粒网络孔径大 小非常有限,所以可 被纯化的物质的分子 量范围受到限制。
3.凝胶结构对某些溶质 分子具有吸附作用。
实用文档
47
（一） 载体的选择
1、载体要求： （1）不溶性 （2）渗透性：疏松网状结构，有良好的液
体流动性 （3）化学和机械性能稳定 （4）具备大量能被活化的基因 （5）抗微生物和酶的侵蚀
实用文档
48
2、常用载体
（1）纤维素 特点：价廉、来源充足
纤维性、非均一性限制大分子的掺入 非专一性吸附严重 用于抗体和酶的纯化
12
纸层析
薄层层析
实用文档
13
三.层析的一般原理
1.分配系数 表示一种物质在两种特定相（流动相和固定 相）中分配程度。
溶质在固定相中的浓度 Cs
K= ———————————— = — — C⇋⇋m特 K大定：的被温溶的固度质移定：在动相常流速吸数动度附相较的中慢牢的。固浓，度随流动相
实用文档
14
在不同条件下，吸附剂 与被吸附物之间的作用
对不同物质的吸附力而 物理作用的范德华吸附：无
使混合物分离的方法。 选择性，吸附速度快，吸
附的过程是可逆的
化学吸附：由原子价力的作 用引起。有选择性，吸附 速度较慢，不易解吸
在单位时间内被吸附于吸附剂的某一表面积上的分子和 同一单位时间内离开此表面的分子之间可以建立动态平衡， 吸附层析就是不断地产生平衡与不平衡，吸附与解吸。
分子筛层析（molecular sieve chromatography）
(Hjertén, Mosbach, 1962)
排阻层析 （exclusion chromatography）
(Pedersen, 1962)
指混合物随流动相经固定相的层析柱时， 混合物中各组份按其分子大小不同而被分离 的技术。
（5）多孔玻璃 特点：不受微生物的侵蚀
耐酸、碱、有机溶剂 表面非专一性吸附
实用文档
51
（二）配基的选择 1、对于欲纯化的物质应有专一亲和力 2、必须具备能被修饰的功能基团
实用文档
52
以酶和底物为例K：L：解离常数
E：酶
KL
E+L
EL
L：底物 EL：复合物
KL =[E][L]/[EL]=[E0-EL][L0-EL]/[EL]
பைடு நூலகம்
G-75 3,000~70,000
G100 4,000
~150,000
G150 5,000
实用文档
吸水性 G类的型号 表示每克干凝胶吸
水量（ml）x10 如G-50
每克干凝胶吸 水量为5ml。
28
2.琼脂糖凝胶（商品名为Sepharose)
大孔凝胶 工作范围的下限几乎是 Sephadex的上限 可分离MW40万以上的物质 可用来分离核酸及病毒。