(末端标记 末端标记) 末端标记
游离状态→ 游离状态 不发荧光
杂交状态→ 杂交状态 不发荧光
酶切之后→ 酶切之后 两端都发荧光
AllGlo Probes(Type II)
(中间标记) 中间标记
5´ 游离状态→ 游离状态 不发荧光 3´
杂交状态→ 杂交状态 不发荧光
酶切之后→ 酶切之tra: 500/525 nm (FAM region)
1000 nM 500 nM 250 nM 125 nM
1000 nM 500 nM 250 nM 125 nM
AllGlo (MAR)
TaqMan® (FAM/TAM)
0
10
20
30 40 Cycle Number
50
60
* Optics optimized for FAM; All conditions are same except labels
AllGlo Probe 灵敏度和 灵敏度和Mix的关系 的关系
谢 谢！
打造最专业的DNA合 合 打造最专业的 成及标记公司
李辉 2008-12-10
DNA 合 成 简 介
亚磷酰胺法
亚磷酰胺法示意图 亚磷酰胺法示意图
• 合成流程
荧光标记的方法
1. 亚磷酰胺法单体
5’-Biotin
3’-Biotin
荧光标记的方法
2. 活化脂
5’-Aminolink
活化脂
影响合成质量的因素
一. 原料
1. 超世生物基本合成试剂全部采用原装进口Sigma（Proligo）（DNA合成稳定性） 超世生物基本合成试剂全部采用原装进口 （ ） 合成稳定性） 合成稳定性 2. 超世生物采用的标记及修饰原料全部是经过严格测试筛选，固定下来几家全球 超世生物采用的标记及修饰原料全部是经过严格测试筛选， 知名的染料供应商： 知名的染料供应商：Biotium、Glenresearch、Biosearch Technologies、Proligo等 、 、 、 等 （试剂纯度高、标记效率高、荧光稳定） 试剂纯度高、标记效率高、荧光稳定）
常用荧光基团波长及淬灭基团选择
Black Hole Quenchers
新一代实时定量探针－ 新一代实时定量探针－AllGlo Probe
• • • • • • • 不需要专门的报告或淬灭基团 合成简单 灵敏度高 大大提高tm值 大大提高 值 设计简单 合成周期短 适用领域广
AllGlo Probes (Type I)
多通道荧光选择
(Blue region)
Reactive oligo
(Cy5 region)
(FAM region)
(TexasRedTM region)
(VICTM region)
(TAMRA region)
AllGlo Probe实时定量曲线 实时定量曲线
Relative Fluorescence
二. 技术及理念
工业化给我们的带来了很多！ 工业化给我们的带来了很多！可能丢失了合成其实也是分子生物学一部分
三. 仪器及环境
TaqMan法 法
Taq酶的外切活性 酶的外切活性
如何确定阈值：基线的作用
基线的范围： 阈
标 准 基线范围 偏
值 高 度
差
从第3个循环起 3 到指数增长前3个循环。 一般取3-15循环。 根据实验结果调整。