万方数据ＩＳＳＮ１６７３—８２２５ＣＮ２１．１５３９／Ｒ赵凌云，等人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养ｗｗＭ．ｚｇｌｃｋｆ，ｃｏｍｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍ０引言骨髓间充质干细胞是具有形成骨、软骨、脂肪、神经和成肌细胞能力的多种分化潜能的细胞亚群，取材方便，易于体外扩增，可进行自体移植，而不存在组织配型和免疫排斥的问题，被认为是骨组织工程中最佳的种子细胞。
本实验目的在于建立一种可行的骨髓间充质干细胞取材和分离扩增的培养方法。
１材料和方法设计：开放性实验。
单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科。
材料：实验于２００６—０２／１２在解放军济南军区总医院脊髓修复科完成。
骨髓来源于解放军济南军区总医院脊髓修复科收治的脊髓完全性损伤患者，对本实验均知情同意。
基础培养液由含体积分数为０．１５胎牛血清和低糖仪一ＭＥＭ配置。
低糖ｄ－ＭＥＭ培养基（Ｈｙｃｌｏｎｅ）；淋巴细胞分离液（密度１．０７７ｇ／ｍＬ，上海试剂二厂生产）；胰蛋白酶，胎牛血清（Ｇｉｂｉｃｏ）；Ｃ０２培养箱（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦ９０）；生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司，ＨＦｓａｆｅ一１２００／ｃ）；倒置显微镜（Ｌｅｉｃａ）；离心机（ＪＯＵＡＮＢ４ｉ多功能台式机）。
设计、实施、评估者：设计、实施为第一作者，评估为第二、三作者，均经过系统培训，未使用盲法评估。
方法：骨髓间充质干细胞的分离及传代培养：在无菌条件下，以含５ｍＬ肝素钠生理盐水的２０ｍＬ注射器，于患者髂后上棘穿刺抽取骨髓组织６ｍＬ，移入含５ｍＬ肝素钠生理盐水的试管内，混匀，而后沿管壁缓慢加入含１０ｍＬ淋巴细胞分离液的离心管中，２０００ｒ，ｍｉｎ离心２０ｍｉｎ，小心吸取界面层细胞，用Ｄ—Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液洗２次，２０００ｒ／ｍｉｎ离心８ｍｉｎ，加入基础培养液，血细胞计数板计数，调整细胞的浓度，将细胞悬液按１０９—１０１０Ｌ－１接种于培养瓶，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２饱和湿度孵箱中培养。
于培养后的两三天更换培养液，并用Ｄ－Ｈａｎｋｓ平衡盐溶液冲洗２次，以去除未贴壁的造血细胞，以后每３ｄ换液一次，进一步去除未贴壁的细胞。
观察细胞生长情况，待细胞融合成片、长满培养瓶底部后，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶流过所有细胞表面，盖好瓶盖，将培养瓶放在倒置显微镜下观察，发现细胞变圆，部分脱壁，控制消化时间不超过３ｍｉｎ，立即加入２ｍＬ有血清培养液终止消化，用弯头吸管轻轻吹打细胞生长区域，吹打过程中不要用力，结束后再用少量培养液漂洗一遍，然后加入适５６５０量培养液计数，分别接种在新的培养瓶内。
骨髓间充质干细胞的生长曲线的绘制：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养。
以细胞数为纵坐标，时间为横坐标，绘制细胞生长曲线。
骨髓间充质干细胞贴壁率的测定：取第３代生长状态良好的细胞，用质量浓度为２．５ｇ／Ｌ的胰蛋白酶消化制成细胞悬液，接种至２４孔培养板，３孔／组，细胞１×１０４／孔，每孔加入培养液１ｍＬ，放置３７℃、体积分数为０．０５的Ｃ０２孵箱中培养，每隔２ｈ进行细胞贴壁率检测。
主要观察指标：①骨髓间充质干细胞的形态学观察。
②骨髓间充质干细胞的生长曲线。
③骨髓间充质干细胞的贴壁率。
统计学分析：由第一作者采用ＥＳＡ４．０软件进行统计处理，数据以娃ｓ表示。
２结果２．１骨髓间充质干细胞的形态学观察倒置显微镜下，骨髓间充质干细胞接种１ｄ即贴壁，２ｄ时贴壁细胞较多。
经冲洗和换液去除悬浮细胞后，贴壁细胞继续培养３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（图１）。
至１４ｄ细胞密集在集落中心，基本铺满瓶底，第３～５代细胞呈均匀一致的长梭型，排列成旋涡状或放射状（图２）。
图１原代培养的骨髓间充质干细胞贴壁后３ｄ开始增殖，伸展为椭圆型、短梭型、多角型及不规则型等（倒置显微镜，ｘ２０）２．２骨髓间充质干细胞的生长曲线骨髓间充质干细胞传代后３ｄ内处于潜伏期，３ｄ后进入生长期，７ｄ后进入平台期。
第３代骨髓间充质干细胞生长曲线见图３。
Ｐ．Ｏ．Ｂｏｘ１２００。
Ｓｈｅｎｙａｎｇ１１０００４ｋｆ２３３８５０８３＠ｓｉｎａ．ｃｏｍｗｗｗ．ｚｇｌｃｋｆ．ｃｏｍ 万方数据 万方数据人骨髓间充质干细胞的贴壁分离与体外培养作者：赵凌云， 钱淑琴， 赵廷宝， Zhao LY， Qian SQ， Zhao TB作者单位：解放军济南军区总医院脊髓修复科,山东省济南市,250031刊名：中国组织工程研究与临床康复英文刊名：JOURNAL OF CLINICAL REHABILITATIVE TISSUE ENGINEERING RESEARCH年，卷(期)：2007，11(28)被引用次数：1次1.Lisignoli G.Remiddi G.Cattini L An elevated number of differentiated ostteoblast colonies can be obtarined from rat bone marrow stromal cells using a gradient isolation procedure 2001(01)2.张本斯.王凡.邓力大鼠骨髓间充质干细胞的分离纯化与初步鉴定[期刊论文]-中国组织化学与细胞化学杂志2003(02)3.Zohar R.Sodek J.Mcculloch CA Characterization of stromal progenitor cells enriched by flow cytometry 1997(09)4.Encina NR.Billotte WG.Hofmann MC Immunomagnetic isolation of osteoprogenitors from human bone marrow stroma 1999(04)5.刘晓丹.郭子宽.李秀森人骨髓间充质干细胞分离与培养方法的建立[期刊论文]-军事医学科学院院刊 20006.Hattan N.Kawaguchi H.Ando K Purified cardiomyocytes from bone marrow mesenchymal stem cells produce stable intracardiac grafts in mice 2005(02)7.李秀森.郭子宽.刘晓丹人间充质干细胞的培养及向软骨细胞分化[期刊论文]-解放军医学杂志 2002(12)8.付文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的培养及多能研究[期刊论文]-中华血液学杂志 2002(04)9.冯凯.裴雪涛间充质干细胞--现代组织工程的新资源 2000(06)10.艾国平.粟永萍.闫国和骨髓间充质干细胞的分离与培养[期刊论文]-第三军医大学学报 2001(05)11.付文玉.路艳蒙.朴英杰人骨髓间充质干细胞的分化与端粒酶活性[期刊论文]-第一军医大学学报 2001(11)12.李秀森.郭子宽.杨靖清骨髓间充质干细胞的生物学特征[期刊论文]-解放军医学杂志 2000(05)13.路艳蒙.付文玉.朴英杰人骨髓间充质干细胞的培养及性质鉴定[期刊论文]-第一军医大学学报 2001(08)14.D'lppolito G.Schiller PC.Perez-Stable C Cooperative actions of hepatocyte growth factor and 1,5-dihydroxyvitamin D3 in osteoblastic differentiation of human vertebral bone marrow stromal cells 2002(02)15.Stamm C.Westphal B.Kleine HD Autologous bone-marrow stem-cell transplantation for myocardial regeneration 2003(9351)16.郭子宽.刘晓丹.李秀森人骨髓间充质干细胞体外分化为神经元样细胞[期刊论文]-中国实验血液学杂志2001(01)nge C.Bassler P.Lioznov MV Hepatocytic gene expression in cultured rat mesenchymal stem cells 2005(01)18.Wang D.Park JS.Chu JS Proteomic profiling of bone marrow mesenchymal stem cells upon transforming growth factor beta1 stimulation 2004(42)1.学位论文袁军正常及再障模型小鼠骨髓间充质干细胞的分离、培养和鉴定2007目的：骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMMSCs)是骨髓中造血干细胞之外的另一类干细胞。
它具有极高的横向分化和复制能力，在不同诱导条件下具有多向分化潜能。
目前常用于培养骨髓间充质干细胞的方法主要有全骨髓培养法和密度梯度分离法。
前者简单易行，将骨髓全部接种，利用干细胞贴壁时间短，通过换液达到分离、纯化的目的；后者是将淋巴细胞分离液分离出的单个核细胞接种。
目前尚无一种标志物能作为MSCs的身份特征，国际上通常采用多种CD分子的组合综合界定。
MSCs是正常造血功能赖以存在和发挥功能的必要支持，因而在再生医学领域中有着广泛的应用前景。
本实验以小鼠骨髓为MSC来源，旨在摸索有效、可行的骨髓间充质干细胞的分离、培养方法，对所培养的BMMSC进行鉴定，并检测这种培养法的产率。
临床上恶性血液病患者经反复放、化疗，常出现骨髓造血恢复延迟，有较长时间的低细胞期。
研究表明：骨髓恢复延迟可能与骨髓基质损伤有关。
BMMSC是骨髓基质的组成之一，故我们利用小鼠研究BMMSC损伤时的分离、培养，并观察此时小鼠BMMSC的状况，为临床治疗方面提供新的思路。
方法：1、动物：选用清洁级4～6周龄BALB/c(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为骨髓细胞来源。
清洁级4～6周龄DBA/2(H-2<'d>)小鼠(雌雄各半)为免疫细胞来源，饲养于无菌层流柜中。
2、MSC的分离和培养全骨髓培养贴壁筛选法：将BALB/c小鼠颈椎脱臼处死，超净台内无菌分离小鼠股骨及胫骨，以CCM(完全培养基，为F12-DMEM培养液，含青霉素100μg/ml、链霉素100μg/ml、hEPES液0.03mol/L以及10％FBS)冲洗骨髓腔，轻柔吹打冲洗液，制成单细胞悬液，直接接种于25cm<'2>一次性无菌塑料培养瓶中，为P0(Passage 0)代。