淮北师范大学信息学院07生物工程实验课题：利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案设计成员：万纹纹王磊陈晨夏柱宝指导老师：高翔利用黑曲霉生产柠檬酸的实验设计方案实验步骤： 筛选 → 诱变 → 培养基条件 → 发酵→ 产品分离纯化 一、 菌种的筛选：1、 土壤采样：采样人： 万纹纹 王磊 陈晨 夏柱宝 采样时间：采样地点： 环境条件：用取样铲，将表层5cm 左右的浮土除去，取5～25cm 处的土样10～25g ，装入事先准备好的塑料袋内扎好。

应在三处不同的地点进行采样，将采集好的样品带回实验室备用。

2、 倒平板： 将PDA 培养基加热融化，待冷却至55-60℃倒平板15皿。

PDA 培养基配方：马铃薯 200g 蔗糖 20g 琼脂 20g 蒸馏水 1000ml PH 自然3、 制备土壤稀释液：各称土样10g ，迅速倒入带玻璃珠的90mL 无菌水的三角瓶中(玻璃珠用量以充满瓶底力最好)，振荡约20min ，使土样充分打散，用一支1ml 无菌吸管从中吸取1ml 土壤悬液加入盛有9ml 无菌水的大试管中充分混匀，然后在用无菌吸管从此试管中吸取1ml 加入另一盛有9ml 无菌水的试管里，混合均匀，以此类推制成110-、210-、310-、410-、510-、610-不同稀释度的土壤溶液。

4、 涂布：将倒好平板的底面用记号笔标上410-、510-和610-三种稀释度，然后用无菌吸管分别由410-、510-和610-三管土壤稀释液中各吸取0.1ml 对号放入已写好稀释度的平板中，用无菌玻璃涂棒在培养基表面轻轻地涂布均匀，室温静置5-10min ，使菌液吸附进培养基。

5、 培养： 将涂布好的平板倒置于35℃的培养箱中培养3-5d.6、 挑菌落：黑曲霉形态特征：在固体培养基上，菌落由白色逐渐变至棕色。

孢子区域为黑色，菌落呈绒毛状，边缘不整齐，菌丝有隔膜和分枝，是多细胞的菌丝体，无色或有色，有足细胞，顶囊生成1层或2层小梗，小梗顶端产生一串串分生孢子。

用灭菌后的接种环在单个菌落上挑取少许要分离的细胞，接种到PDA 培养基的斜面上。

置于35℃的培养箱中培养，待菌苔长出后观察其特征是否一致。

7、 划线分离： 用灭菌后的接种环挑取斜面培养基上的菌落在培养皿中划线。

此步需要9个培养皿。

（注意：接种的过程最好在接种箱内进行。

）将已划线的培养皿置于35℃的培养箱中培养3-5d 。

观察菌落特征是否一致。

8、 镜检：在载玻片上加一滴乳酸石炭酸棉蓝染色液，用解剖针从霉菌菌落边缘挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以洗去脱落的孢子，再放在载玻片上的染液中，用解剖针小心地将菌丝分散开。

盖上盖玻片，置低倍镜下观察，必要时换高倍镜观察。

检查是否为单一的微生物。

若发现有杂菌，需要再一次进行分离、纯化，直到获得纯培养。

（试剂：乳酸石炭酸棉蓝染色液；仪器用具：无菌吸管，载玻片，盖玻片，解剖针，镊子，50%乙醇及显微镜等）9、 制备母斜面：用灭菌的接种环将三种划线平板中的纯种黑曲霉接种到斜面上，作为母斜面，35℃培养，备用。

10、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入斜面孢子2环，于30~33℃培养。

旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120次/min 。

发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸高者进一步纸层析或五溴丙酮法测定柠檬酸含量，将产柠檬酸高的菌株保藏下来。

（要求对三个母斜面都进行检测。

）二、诱变育种：1、菌悬液的制备经过筛选的具有高产酸能力的斜面菌种培养3~4d 后，用生理盐水将孢子洗下，接到营养丰富的培养基中，振荡4~5h ，使孢子活化萌发，离心分离，用pH6.0的Tris 缓冲液或磷酸盐缓冲液对孢子洗涤1次。

再以同样的缓冲液将孢子从离心管中洗出转到小三角瓶里，用玻璃珠振荡打散，使孢子成为单孢子，然后通过一层宣纸或脱脂棉过滤，制成单孢子悬浮液，并调整到孢子浓度为710个/ml 。

2、诱变处理常用诱变剂及方法有γ射线、高温、亚硝基胍、紫外线、X 射线、快中子、亚硝基甲基脲和硫酸二乙酯等。

（注意诱变剂的剂量、诱变处理的pH 、温度和时间）将孢子悬浮液和亚硝基胍或其它诱变剂溶液按一定比例混合，在26~28℃下作用2~3h ，分离离心，再反复用缓冲液或生理盐水洗孢子10次以上，最后用生理盐水恢复到孢子悬浮液原体积。

稀释410~510倍，取0.1ml 涂平板，按变色圈法挑选菌落。

（或使用UV 照射，取5ml 孢子悬浮液置于直径6cm 的培养皿中，开盖照射，时间不少于10~20s ，也不长于10~20min ） 3、变异株的筛选①、形态筛选：凡是小菌落、边缘整齐、孢子蕙大而稀疏、液体培养能形成菌球体、菌落颜色变浅者，极可能是高产菌株。

②、指示剂显色法：跟上述柠檬酸生产菌株的分离、筛选中的指示剂显色法相同。

③、透明圈法：在培养剂中加3CaCO 2%，菌落形成后，产生的酸会与3CaCO 反应形成明显的透明圈，其中透明圈直径与菌落直径之比较大的菌株可能是高产菌株。

4、、产酸能力的检测： 将培养基50ml 分装到250ml 三角瓶内，灭菌后接入变异后的菌株2环，于30~33℃培养。

旋转式摇床的转速为300r/min ，往复式摇床振幅6cm ，频率为120次/min 。

发酵4~6d ，取发酵液1ml ，用0.1mol/LNaOH 滴定其酸度，对产酸大幅提高的变异菌种进行扩大培养。

5、突变菌株的保藏：斜面传代法，将突变株接入斜面，在30℃下培养3~5d ，然后置于4~5℃冰箱中保藏，最长可保藏3~4个月。

三、 培养基条件：本实验采用液体发酵培养，培养基配方如下：土豆 200g （煮汁） 蔗糖 100g NH4NO3 2.0g KCI 0.15gMgSO4 0.25g水1000mlPH 5分装：每瓶100ml；棉塞或8层纱布；0.08Mpa，20min。

四、发酵：1、柠檬酸生产菌种的扩大培养方法①、第一级扩大培养，斜面培养，确认所制成的斜面无杂菌污染后，接入黑曲霉孢子悬液0.1ml，于32℃培养4~5d。

②、第二级扩大培养，有琼脂固体培养和液体表面培养两种方法，前者与斜面培养基组成相同，后者为液体培养基，固体培养时，500ml茄子瓶装80ml琼脂培养基，250ml茄子瓶装50ml琼脂培养基。

灭菌后摆成斜面，凝固后的斜面置37℃下培养2d，确认无杂菌污染即可使用；液体培养时，将液体培养基装入三角瓶中使液层深度达4~5cm，于100kPa 下湿热灭菌15min，按无菌操作，培养温度32℃。

液体表面培养需7~10d，琼脂固体培养需6~7d。

③、第三级扩大培养，琼脂固体培养基与斜面培养基相同，液体培养基与第二级扩大培养所需用液体培养基相同。

当进行液体表面培养时，可在1000ml或2000ml三角瓶中进行，液体培养在容器中的液层深度为4~5cm。

采取固体表面培养时，则将含琼脂的培养基放入广口容器中，培养层厚度达到4~5cm，用8层纱布封扎容器口，灭菌，冷却凝固后即可用来接种。

2、柠檬酸深层发酵1、操作步骤在发酵罐内装有35℃、已经液化处理过的薯干粉液化液，装液量为罐体积的85%，还原糖含量18%。

将种子罐中已培养到小球状菌丝体的三级种子液倒入发酵罐内，接种量为10%。

罐压为0.1MPa，发酵18h前的通风量为0.08~0.1m³/h，在18~30h时，通风量调整为0.12 m³/h，30h后升高到0.15m³/h。

200rpm，28℃；接种后每24h取样测定、记录发酵液pH。

发酵将近4d。

在发酵0~40h左右时，应将发酵液的pH控制在3.6~4.0，当发酵进入60h左右时，则应将发酵液pH控制在2.5以下。

当发酵液残糖在0.2~0.5%，酸度不在上升时，发酵即结束。

发酵进行到24~28h，以每毫升发酵液添加5~10g的量往发酵液中加入灭过菌的碳酸钙，，让发酵液pH维持在2.5~2.8,这对生物合成柠檬酸是十分有利的。

使用硝酸铵作为氮源，对培养基的pH几乎不产生影响。

3、酸度测定酸度—是指100ml发酵液所含柠檬酸的克数。

方法：取发酵液滤液或离心液1ml，以酚酞为指示剂，用0.1429～0.1430mol/L标准NaOH 溶液滴定至淡粉红色，所消耗的NaOH毫升数即为发酵液酸度。

4、发酵条件控制：柠檬酸的发酵因菌种、工艺、原料而异，但在发酵过程中还需要掌握一定的温度、通风量及pH值等条件。

①、温度：一般认为，黑曲霉适合在28～30℃时产酸。

温度过高会导致菌体大量繁殖，糖被大量消耗以致产酸降低，同时还生成较多的草酸和葡萄糖酸；温度过低则发酵时间延长。

②、pH要求：微生物生成柠檬酸要求低pH，最适pH为2～4，这不仅有利于生成柠檬酸，减少草酸等杂酸的形成，同时可避免杂菌的污染。

③、溶氧量：柠檬酸发酵要求较强的通风条件，有利于在发酵液中维持一定的溶解氧量。

通风和搅拌是增加培养基内溶解氧的主要方法。

随着菌体生成，发酵液中的溶解氧会逐渐降低，从而抑制了柠檬酸的合成。

采用增加空气流速及搅拌速度的方法，使培养液中溶解氧达到60％饱和度对产酸有利。

柠檬酸生成和菌体形态有密切关系，若发酵后期形成正常的菌球体，有利于降低发酵液粘度而增加溶解氧，因而产酸就高；若出现异状菌丝体，而且菌体大量繁殖，造成溶解氧降低，使产酸迅速下降。

④、其它因素：发酵液中金属离子的含量对柠檬酸的合成有非常重要的作用,过量的金属离子引起产酸率的降低, 由于铁离子能刺激乌头酸水合酶的活性，从而影响柠檬酸的积累。

柠檬酸发酵用的糖蜜原料，因含有大量金属离子，必须应用离子交换法或添加亚铁氰化钾脱铁方能使用。

然而微量的锌、铜离子又可以促进产酸。

五、产品的分离纯化：实验材料：CaCO3（或CaO）、稀硫酸、活性炭、烧杯、蒸发皿、纱布、离心机、过滤漏斗、石棉网、玻璃棒、pH试纸、）1、柠檬酸的分离a.发酵液经2～4层纱布过滤（如需要可再用滤纸过滤一次）或经离心（菌丝球很小的过滤太慢）取滤液b.加热至70℃，慢慢加入适量CaCO3（或CaO），中和至pH6.0～6.5；c.过滤得柠檬酸钙。

d.向所得的柠檬酸钙中加入稀硫酸使柠檬酸钙溶解，得到柠檬酸和硫酸钙沉淀。

进行过滤，得到柠檬酸溶液。

2、柠檬酸的纯化将稀释的柠檬酸溶液用活性炭脱色，并蒸发形成柠檬酸结晶。

通过离心回收晶体，然后干燥并包装。

附：PDA培养基的制备1、将马铃署去皮,切成约2cm2 的小块,放入1500mL 的烧杯中煮沸30min，注意用玻棒搅拌以防糊底，然后用双层布过滤，取其滤液加蔗糖，再补足至1000mL，自然pH。

调pH通常放在加琼脂之前。

应注意pH 值不要调过头，以免回调而影响培养基内各离子的浓度。