组成
50mM KCl
10mM Tris.Cl (pH 8.4) 1.5mM MgCl2
Mg++是Taq酶活性所必需的金属离子。 Mg++浓度的高低能影响反应 的特异性和扩增片断的产率。1.5~2.0mM Mg++是比较合适的。 Mg++ 过量能增加非特异性扩增并影响产率。
4。底物dNTP浓度
在PCR反应中，dNTP浓度应在20~200uM, dNTP浓度过高可加快反应 速度。同时，还可增加碱基的错误掺入率和实验成本。反之，低浓度
的dNTP会导致反应速度的下降，但可提高实验的精确性。此外，由于 dNTP可能与Mg++ 结合，因此应注意Mg++浓度和dNTP浓度之间的关系。
（三）．怎样提高PCR的特异性
• 1．热启动（hot-start)
•
比如（1）将Taq酶与其它反应体系通过石蜡分隔开
•
（2）利用Taq酶的单克隆抗体抑制其活性。
1，基因组DNA步移法
12345
接头
已知DNA序列
接头
PCR
• 2，Inverse PCR
限制酶切点（X）
已知序列
限制酶切点（X）
限制酶X酶切
连接
引物1
引物2
PCR
(二）利用PCR对基因功能进行 分析和改 造
(三） 基因拼接
（四）In vitro evolution of genecoding protein
(6) 引物5‘末端碱基：PCR反应物5’末端碱基并没有严格限制， 只要与 模板DNA结合的引物程度足够，其5‘末端碱基可以不 与模板DNA匹 配，而呈游离状态。这样引物设计时可以在5‘末端加上限制性内切酶 位点或其他短的序列。可以加ATG起始密码，可以加错配碱基造 成突变。
3。PCR反应缓冲液：
• 1。DNA聚合酶：PCR反应使用的是耐热DNA聚合酶。
•
比如：Taq DNA聚合酶。
• 可分为两大类： （1）具有校正功能的（有3‘5’核酸酶活性）
比如：Vent,pfu,pwo等
2。引物
（2）不具有校正功能的 （无3‘5’核酸酶活性） 比如：一般的Taq DNA聚合酶
（1）引物长度以15~30个bp为宜。引物过短会使特异性降低， 过长时则成本增加，且也会降低特异性。
• 10、人的志向通常和他们的能力成正比例。13:03:2413:03:2413:0310/23/2020 1:03:24 PM • 11、夫学须志也，才须学也，非学无以广才，非志无以成学。20.10.2313:03:2413:03Oct-2023-Oct-20 • 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。13:03:2413:03:2413:03Friday, October 23, 2020 • 13、志不立，天下无可成之事。20.10.2320.10.2313:03:2413:03:24October 23, 2020
（2）引物碱基尽可能随机分布，避免出现嘌呤，嘧啶堆积现象， 引物G+C含量宜在45~55%左右。
（3）引物内部不应形成二级结构，两个引物之间尤其在3‘末端不应 有互补链存在。
（4）引物的碱基顺序不应与非扩增区域有同源性。要求在引物设计时 进行辅助检索分析。
（5）引物3‘末端碱基：原则上要求引物3’末端与模板DNA一定要配对。 另外引物3‘末端的末位碱基在很大程度上影响着Taq DNA聚合酶 的延伸效率。研究表明，引物3‘末端碱基在错误配对时，不同碱基 的引发效率存在很大差异。当末位碱基为A时，即使在错配的情 况下，也能引发链的合成。而末位碱基为T时，错配时引发效率 大大降低。G,C居于中间，所以3‘末端的末位碱基最好选T,G,C而 不选A.
•
Transition： 嘌呤突变为嘌呤，嘧啶突变为嘧啶
•
Transversion: 嘌呤突变为嘧啶
•
2）A或T转变为G或C的程度，或者是反过的分析
1. RT-PCR方法
基本步骤：
mRNA
AAAA
反转录酶和 基因特异引物
分离mRNA
AAAA
PCR
polymerase
． • 4 Amplification of reassembled products by a conventional
PCR
• 怎样提高高保真的重组体
• 1．在步骤2）使用Mn2+而不是Mg2+ ． • 2 在PCR步骤使用高保真的耐热DNA聚合酶
PCR Random Mutagenesis
． • 1 提高PCR反应体系中Mn2+的浓度（可到640uM）
． • 2 在保持Mn2+浓度的基础上，升高dGTP浓度可进一步提高突变率
怎样获得理想的突变率
• 每1000bp含2-6个突变碱基是理想的突变率
• 1．选择缓冲液
• 2．突变偏向（mutational bias)
• 评估方法：1）transition/transversion
mRNA cDNA
反转录合成cDNA
第一轮PCR合 成双链cDNA
PCR
经多轮PCR合成 大量产物
电泳，鉴定
2,Chromatin immunoprecipitation(ChIP)
主要应用:研究转录因子在体内与其顺式作用元件的结合 原理：
3. DNA甲基化的分析
• 9、春去春又回，新桃换旧符。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季节，愿你生活像春天一样阳光，心情像桃花一样美丽，日子像桃子一样甜蜜。2 0.10.2320.10.23Friday, October 23, 2020
• 2. Touchdown
• 先在高于退火温度下进行几轮PCR循环，然后再在 退火温度 下进行大量扩增。
• 3. Nested PCR
• 先在要扩增片断的外侧设计一对引物，进行PCR，然后以此 PCR产物为模板，再在内侧设计一对引物扩增出我们所要的目的 片断。
二 PCR的应用
（一）未知DNA片断的克隆
DNA Shuffle
• 基本过程
． • 1 Preparation of genes to be shuffled ． • 2 Fragmentation with DNase I ． • 3 Reassembly by thermocycling in the presence of a DNA
分子生物学研究方法
PCR技术在医学中的应用
• 一.多聚酶链反应(Polymerase Chain Reaciton,PCR)
• （一）原理
热变性（94度）
退火（55度）
引物
延伸（72度）
DNA聚合酶 dNTP
变性
引物
退火
经25~30次循环， 目的DNA增加166-7
（二）。PCR反应的主要成分和作用