即双链的核酸分子在某些理化因素作用下双链 解开，而在条件恢复后又可依碱基配对规律形 成双链结构。因此应用已知碱基序列的单链核 苷酸片段作为探针，就可检测样本中是否存在 与其互补的同源核苷酸序列。
probe probe
核酸杂交的关键要素
probe DNA target DNA signal detection
核酸杂交方法分类
按作用环境大致分为固相杂交和液相杂交 两种类型。
固相杂交是将参加反应的一条核酸链先固定在固 体支持物上，一条反应核酸游离在溶液中。 液相杂交所参加反应的两条核酸链都游离在溶液 中。
固相杂交分类
Southern 印记杂交 Northern 印记杂交 斑点杂交 原位杂交
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
Southern blot
扩增产物294bp
引物1
MstⅡ酶切位点 (CCTNAGG)
CCT GAG GAG
103bp
191bp 294bp
引物1
CCT GTG GAG
引物2 引物2
镰状红细胞贫血患者PCR产物的限制性酶切分析
294bp
﹣
191bp
103bp
+
正常人 突变携带着 患者
镰状细胞贫血的基因诊断方法
RT-PCR/序列分析
二、镰状细胞贫血
血红蛋白病（异常血红蛋白病） 红细胞呈镰刀状，寿命短，引起溶血性贫 血。 患者多在成年以前死亡
（一）镰状红细胞贫血分子机制
MstⅡ酶切位点(CCTNAGG)
5´
3´
1.15kb
×
56 7
正常基因
--Pro Glu Glu—
--CCT GAG GAG--
5´
3´
1.35kb
56 7
高特异性 高灵敏度 获得稳定的结果 早期快速 适用性强，应用范围广
第二节 遗传病的基因诊断
一、概述
人类的遗传病达数千种 地中海贫血在意大利等国家发病率达10％ 镰状细胞贫血在美国黑人中发病率达14％
我国常见的遗传性疾病有地中海贫血、异 常血红蛋白病和血友病。 有效治疗难；通过基因诊断进行携带者筛 查，产前早期诊断，降低发病率。
0.2kb
+
正常人 突变携带着 患者
镰状细胞贫血的基因诊断方法
PCR/限制性内切酶 设计引物→PCR扩增→产物进行限制性内切酶酶
切→电泳→EB染色→直接观察
例： 引物1：5’-GGG CTG GGC ATA AAA GTCA-3’ 引物2：5’-AAT AGA CCA ATA GGC AGAG-3’
寡核苷酸杂交分析 SNP和等位基因特 异寡核苷酸杂交 （ASO）#
（三） DNA序列测定
DNA序列测定是进行基因突变检测的 最直接、最准确的方法，可以确定突 变的部位，突变的性质。
（四 ） DNA芯片技术
应用DNA芯片，可以检测基因的结构及其突变 多态性，对基因表达的情况进行分析。
二 基因诊断的特点
直接采用PCR进行基因诊断 采用PCR产物的限制性片段长度多态性分析（PCRRFLPs）进行基因诊断 采用PCR结合等位基因特异性寡核苷酸探针（ASO） 斑点杂交进行基因诊断 * 通过PCR产物的反相点杂交(RBD)进行基因诊断 采用PCR产物的单链构象多态性(SSCP)分析进行基 因诊断
采用PCR技术对靶核酸进行定量分析
采集制备血液RNA→RT-PCR→产物测序→推 测氨基酸序列→进行诊断
二、β－地中海贫血 (β－Thalassaemia,简写βthal或βT)
β珠蛋白基因突变导致该多肽链的合成大为减少 （β＋）或完全缺失（β0）
β珠蛋白合成速率降低，导致β链和α链合成的不 平衡→多余的珠蛋白链沉积在红细胞膜上→改变 了膜的通透性和硬度→导致溶血性贫血。 高危人群地中海人、中东人、印度人、中国人； 中国人群中又一广东、广西、四川、贵州等省发 病率最高。 缺乏有效治疗措施。
原位杂交
（Colony in situ hybridization）
可查明染色体中特定基因的位置，用于染色体疾 病的诊断；原位杂交的结果是显示有关核酸序 列的空间位置情况，因此可检出含核酸序列的 具体细胞，细胞的具体定位，数目和类型，可 检出基因和基因产物的亚细胞定位。
（二）利用PCR及结合其他技术进行 基因诊断
突变基因
--Pro Ala Glu—
--CCT GTG GAG--
（二）镰状细胞贫血的基因诊断方 法
限制性内切酶/Southern blot
采集制备血液DNA→内切酶MstⅡ消化→电 泳→转膜→32P标记的β 珠蛋白cDNA杂交→ 放射自显影
镰状红细胞贫血患者基因组的限制性酶切分析
﹣
1.35kb 1.15kb
（一） β地贫病的分子基础
β珠蛋白基因全长2053bp，含2个内含子 （IVS－I和IVS-II），3个外显子。 目前发现突变有百余种，中国人群发现约 20种； 一般对特定种族来说，90%的β地贫基因仅 由4～6种突变组成。
（二） β地中海贫血的基因诊断
PCR/ASO斑点杂交法 合成2对PCR引物（扩增区段700bp和 580bp，分别包含14种和1种可能突变）→ 合成等位特异寡核苷酸(ASO)探针（4～6对， 分别标记） →制备DNA样品 →PCR扩增 →斑点印迹杂交 RFLP分析法
三α地中海贫血的基因诊断
左侧缺失型 基因序列
•PCR扩增法——定性分析
正常基 因序列
左侧缺失4.2kb
a
α1
b
ac扩增0.4kb ab无扩增片段
α2 c
右侧缺失 a
α1
b
右侧缺失型 基因序列
是最经典的基因分析方法，不但能检出特异 的DNA片段，而且能进行定量和测定分子 量，可用于基因的酶切图谱分析、基因突变 分析等。
Northern杂交
用于RNA的检测，能对组织细胞中总RNA 或mRNA进行定性和定量分析。
斑点杂交（Dot blot）
可用基因组中特定基因及其表达的定性及定 量分析，方法简单、快速灵敏、样品用量 少；其缺点是不能鉴定所测基因的分子量， 特异性不高，有一定比例的假阳性。
第一节 基因诊断的概念 及常用技术
一、基本概念
基因诊断—利用分子生物学技术， 从DNA/RNA水平检测基因的存在, 分析基因的结构变异和表达状态， 从而对疾病作出诊断。
二、基因诊断常用方法
㈠ 核酸分子杂交 ㈡ PCR ㈢ DNA序列测定 ㈣ DNA芯片技术
(一) 核酸杂交
基本原理-------核酸变性和复性理论