支原体污染表现
细胞营养液常常仍清亮但变黄,细胞生长变缓，部分细胞发 生脱落等等，细胞间隙可见铺满细沙样小点。
荧光染料Hoechst33258染色法检测支原体
荧光染色法(33258)显示染色体，细胞周围亮点为支原体
Giemsa染色法，附于胞质上黑点为支原体
扫描电镜法显示支原体，附于细胞表面众多的圆 形颗粒为支原体
❖ 联合用药比单独用药效果好。 ❖ 预防用药比污染后再用药效果好，一般用双抗生素。 ❖ 污染后清除用药需采用大于常用量5～10倍药物冲洗
法，于加药后作用24～48小时，再换常规培养液。此 法在污染早期有效。
支原体污染
95％以上是以下四种支原体：
•口腔支原体（M.orale） •精氨酸支原体（M.arginini） •猪鼻支原体（M.hyorhinis） •牛莱氏无胆甾原体（idlawii）
1 mm
0.1 mm
1 mm
Volume : 0.1mm3 1 ml = 1 cm3 = 1000 mm3
Dead cell
细胞计数及活力
细胞计数时的注意事项
①消化单层细胞时，务求细胞分散良好，制成单个细胞悬液。否则 会影响细胞计数结果。
②取样计数前，应充分混匀细胞悬液。在连续取样计数时尤应注意 这一点。否则，前后计数结果会有很大误差。
Hemocytometer Cell Counts
❖ Hemocytometer
The most common routine method for cell counting which is efficient and accurate is with the use of a hemocytometer.
继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞 需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟， 使结晶物充分融解。
4.比色：选择570nm波长，在酶联免疫检测仪上测定各孔光吸收值，记 录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
❖ (三)结果
细胞污染
❖ 细菌污染 ❖ 真菌污染 ❖ 细菌和真菌的清除 ❖ 支原体污染 ❖ 支原体的清除
细菌污染
❖ 细胞培养常见的污染 ❖ 最常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰
氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。 ❖ 培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。 ❖ 污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
应用举例
❖ 1. MTT实验 ❖ 6孔板接种HCCLM3细胞，1*106每孔，后取1*107病毒每孔加入
（LASS2与GFP对照），感染90分钟后，再加入1ml的培养液，24h后， 细胞用胰酶消化成细胞悬液，细胞调密度至1000每孔接种96孔平底板， 每孔100 ul（边缘孔用无菌PBS填充）。
5%CO2，37℃孵育24h后，每孔加入20ulMTT（噻唑兰）溶液 （5mg/ml），继续培养4h。终止培养，小心吸去孔内培养液。每孔加入 150ul二甲基亚砜，37℃孵育15min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检 测仪490nm处测量各孔的吸光值。细胞分为3组：LASS2组，GFP组和 不加病毒对照组，每组3个复孔，同时设置调零孔（培养基、MTT、二 甲基亚砜）。连续检测6天，OD值绘生长曲线。
如：皮肤及其衍生物 消化道，乳腺，肺泡 上皮性肿瘤
形态：类似体内的上皮细胞 扁平，不规则多角形，中有圆形核
生长特点 易相连成片 相靠—紧密相连—成薄层—铺石状 生长时呈膜状移动 很少脱离细胞群而单个活动
成纤维细胞样细胞
名称：凡在培养中形态与成纤维细胞类似的 来源：由中胚层间充质组织起源的组织
如：真正的成纤维细胞 心肌，平滑肌，成骨细胞，血管内皮
贴壁(粘附)型细胞
粘附:是大多数有机体细胞在体内 生存和生长发育的基本存在方式
基于粘附特性，使细胞与细胞之间相互结合形成组织， 有机体的绝大多数细胞必须 粘附于一固相表面 才能生存和生长。
培养时：这些细胞被放到体外环境中以后,同样需要粘附于某 一固相表面才能生存和生长，因而 属于粘附型细胞。
粘附(锚定或锚着)依赖型(性)细胞：唯有粘附于固相表面才能 生存的细胞
❖ (二)操作（实用于贴壁细胞） ❖ 1.接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔
1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul. 2.:培养细胞：同一般培养条件，培养2-3天（可根据试验目的和要求决
定培养时间）。 3.显色：分别培养不同时间，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul.
❖ 以时间为横轴，光吸收值为纵轴绘制细胞生 长曲线或计算细胞生长抑制率、细胞相对增 殖率等。
❖ 【注意事项】 ❖ 1.选择适当得细胞接种浓度。边缘孔用无菌PBS填充。
2.避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在显 色后尽量吸尽孔内残余培养液。 3.设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验 步骤保持一致，最后比色以空白调零。每组设定3复孔。 4.MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。MTT一般 最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存 在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、 锡箔纸包住避光以免分解。 5.酶联免疫检测仪使用前应打开电源预热半小时。 ❖ 6.选择不同的波长，酶联免疫检测仪检测灵敏度不同。应根据实验目的 选择相应的波长。 ❖ 7.悬浮细胞先用平板离心机离心96孔板，2000r，5分钟。或用cck-8。
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真菌污染
❖ 真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作 用而使细胞脱落死亡。
细菌和真菌的清除
使用抗生素
❖ 抗生素对杀灭细菌较有效。（当在无血清培养基中添 加抗生素时，降低至少在有血清培养基中所使用浓度 的50%。血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。在无血 清培养条件下，抗生素不被灭活，可能对于细胞达到 毒性水平）。
特点 在悬浮中生长良好 细胞圆形，单个或小细胞团
优点 生存空间大，提供数量大 传代方便(不需消化) 易于收获 可获得稳定状态
缺点 观察不方便 很多细胞不能悬浮生长(尤以正常细胞)
❖ 贴壁细胞在生长状态良好时，细胞内颗粒少，看不到有空泡， 细胞边缘清楚，培养基内看不到悬浮的细胞和碎片，培养液 清澈透明，而当细胞内颗粒较多，透明差，空泡多时，表明 生长较差。当瓶内培养基混浊时，应想到细菌真菌污染的可 能。悬浮细胞当边缘清楚，透明发亮时，生长较好；反之， 则较差或已死亡。由于培养基内有 pH 指示剂的存在，因此 它的颜色往往可以间接地表明细胞的生长状态。呈橙黄色时， 细胞一般生长状态较好；呈淡黄色时，则可能是培养时问过 长，营养不足，死亡细胞过多；如呈紫红色，则可能是细胞 生长状态不好，或已死亡。
死支原体，但对细胞有不良影响。 ➢ 支原体特异性血清法 • 用5%的兔支原体免疫血清可去除支原体污染，因特异抗体可抑制支原
体生长，故经抗血清处理后11天即转为阴性，并且5个月后仍为阴性。
二、培养细胞的计数及活细胞的鉴定
❖ 在细胞生物学的实验中，往往要进行活细胞 的鉴定和细胞的计数、调整细胞的密度，是 进行实验必不可少的一种基本技能。
危害：
世界性问题，平均发生率达到11% 能改变细胞的DNA,RNA及蛋白表达 不能通过可视法对其进行检测 对细胞的生长率影响较小，不易引起注意污染 来源： •操作环境不良 •操作人员的疏失 •实验器具不洁等 •已受污染的细胞 •已受污染的培养基、血清
支原体污染检测
➢荧光染色法 ➢电镜检查：扫描电镜、透射电镜 ➢支原体培养 ➢聚合酶链反应(PCR)法
③镜下计数时，遇见2个以上细胞组成的细胞团，应按单个细胞计数。 如细胞团占10%以上，说明消化不充分。
④细胞数少于200个/10mm2或多于500个/10mm2时，说明稀释不当， 需重新制备细胞悬液。
⑤在计数板上盖玻片的一侧加微量细胞悬液时，加液量不要溢出盖 片，也不要过少或带气泡。
⑥在计数过程中，对大方格的边缘压线细胞应按数上不数下，数左 不数右的原则进行计数。
胞计算，若细胞团占10%以上，说明分散不好，需重新制备 细胞悬液。
2．细胞活力 ①将细胞悬液以0.5ml加入试管中。 ②加入0.5ml 0.4%台盼兰染液，染色2一3分钟。 ③吸取少许悬液涂于载玻片上，加上盖片。
④镜下取几个任意视野分别计死细胞和活细胞数， 计细胞活力。
死细胞能被台盼兰染上色，镜下可见深兰色的细胞， 活细胞不被染色，镜下呈无色透明状。另外，活力 测定可以和细胞计数合起来进行，但要考虑到染液 对原细胞悬液的加倍稀释作用。
形态：似体内成纤维细胞的形态 胞体梭形或不规则三角形 胞质向外伸出2—3个长短不等的突起 中有卵圆形核
生长特点 排列成放射状，漩涡状 并不紧靠连成片， 细胞—细胞接触易断开而 单独行动 游离的单独的成纤维样细胞， 常有几个伸长的细胞突起
培养细胞形态不稳定
血清 Hela
高血清
低血清
成纤维细胞样 上皮样细胞
⑦染色标本在计数细胞时必须在15分钟内检查计数完毕。因为台盼蓝染液可 以将死细胞迅速地染上蓝色，再延长时间则活细胞也将逐渐着色。
细胞增殖实验（MTT法）
❖ (一)原理
❖ MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di-phenytetrazoliumromide, MTT（噻唑蓝）为 基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作 用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素 C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶， formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥 珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan 结晶可以用DMSO来溶解，利用酶标仪测定570 nm处的光 密度OD值，以反映出活细胞数目。