AOAC 官方方法999.03 食品中总果糖的测定酶/分光光度法1999年第一次执行（适用于食品中果糖的测定。

不适用于高度解聚的果糖，无论是酸的还是酶的。

）支持方法验收的实验室间研究结果见表999.03。

A.原理用热水提取产物以溶解果聚糖。

将等份的提取物用特定的蔗糖酶处理以将蔗糖水解成葡萄糖和果糖，并用纯淀粉降解酶的混合物将淀粉水解成葡萄糖。

所有还原糖用碱性硼氢化物还原成糖醇。

果聚糖用纯化的果聚糖酶（外切-菊粉酶加内切-菊粉酶）水解成果糖和葡萄糖，并且这些糖通过β-羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）方法测量用于还原糖。

B.装置设备（a）研磨机。

（b）热板。

带磁力搅拌器。

（c）水浴.保持40±0.1℃。

（d）沸水浴。

（e）涡旋混合器。

（f）pH计。

（g）停止计时器。

（h）滤纸。

（i）真空烘箱。

用于干燥果糖标准品。

（j）分光光度计。

在410nm下操作。

（k）移液管。

用一次性吸头输送100和200μL。

或者，可以使用机动手持式分液器。

（l）正位移移液器。

（m）玻璃试管。

（n）容量瓶。

（0）聚丙烯容器。

C.试剂所有试剂应具有分析纯度等级。

（a）马来酸钠缓冲液。

100mM。

pH 6.5。

将11.6g马来酸溶于900mL蒸馏水中，用2M NaOH（8.0g NaOH / 100mL）将pH调节至6.5，并用水稀释至体积1L容量瓶中。

储存在4℃。

（b）乙酸钠缓冲液。

100mM。

pH 4.5。

将5.8 mL冰醋酸（1.05 g / mL）吸取到900 mL蒸馏水中。

使用1M NaOH调节至pH 4.5并用水稀释至1L。

储存在4°C。

（c）对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）还原糖分析试剂.（1）溶液A.-在磁力搅拌器上，在250mL烧杯中加入10g PAHBAH至60mL水中。

搅拌浆液并加入10mL浓HCl。

用蒸馏水调节至200 mL并在室温（约22°C）下储存。

溶液稳定至少2年。

（2）溶液B.-将24.9g柠檬酸三钠二水合物加入500mL蒸馏水中并搅拌溶解。

加入2.20g CaCl2·2H20并通过静置溶解。

然后加入40.0g NaOH并用静止溶解。

（溶液可能是乳状液，但会在稀释时澄清。

）将体积调节至2 L。

在室温（约22°C）下溶液稳定至少2年。

（3）PAHBAH工作试剂，现配现用。

将20 mL 溶液A加入180 mL溶液B中并充分混合。

该溶液应储存在冰上并稳定约4小时。

（d）氢氧化钠。

50mM。

将2.0g NaOH溶于900mLL蒸馏水中。

将体积调节至1 L。

在室温下保存（约22℃）。

（e）碱性硼氢化物.-将50mg硼氢化钠准确称入聚丙烯容器中。

记录管上的重量，密封管并存放在干燥器中以供使用。

使用前即刻。

将硼氢化钠（10mg / mL）溶于50mM NaOH溶液中。

该溶液在室温下稳定4-5小时。

（f）乙酸。

100mM。

将5.8 mL冰醋酸加入蒸馏水中，并将体积调节至1 L。

在室温下（约22°C）储存。

（g）蔗糖酶/淀粉酶制剂。

2.27单位（U）蔗糖酶/毫升。

溶解在1瓶含有蔗糖酶（50 U）和（β-淀粉酶（蜡状芽孢杆菌，500 U），支链淀粉酶（地衣芽孢杆菌，100 U）和麦芽糖酶（酵母.1000 U）（作为冻干粉末）在22mL马来酸钠缓冲液。

C（a）将酶溶液分成5 mL每份，并冷冻储存在聚丙烯容器中以防止微生物污染。

如果不在缓冲液中稀释，则在-20℃下储存时，该灭菌酶可稳定5年。

一个单位蔗糖酶活性是在pH6.5和40℃下从蔗糖释放1微摩尔葡萄糖/分钟所需的酶量。

（h）果聚糖酶溶液。

350U / mL外切-菊粉酶和35U/mL内切-胰岛素酶。

将含有8000U外切-菊粉酶和800U内-缬氨酸酶溶解在装有22mL乙酸钠缓冲液的瓶子中，C（b）。

将酶溶液分成5mL等分试样并冷冻储存在聚丙烯容器中以防止微生物接触。

如果不在缓冲液中稀释，则在-20℃下储存时，干燥的酶可稳定5年。

一个单位（U）外切-菊粉酶活性是在pH4.5和40℃下从半胱氨酸（10mg / mL）释放1μm的还原糖当量（作为果糖）/ min所需的酶量。

（i）果聚糖对照面粉。

含有已知量的在α-纤维素存在下冷冻干燥的dahlia 果聚糖。

在室温下干燥储存时稳定。

（j）蔗糖对照面粉。

在α-纤维素存在下冷冻干燥的蔗糖。

在室温（约22°C）下储存时稳定。

（k）D-果糖标准储备溶液。

1.5mg / mL，在0.2％苯甲酸溶液中。

在制备溶液之前，将干燥的粉状结晶果糖（纯度> 97％）在60℃下进行16小时真空吸尘。

D.测试材料的制备所有产品在称重前应在室温（22℃）下进行。

（a）测试样品。

对于干燥食品，在研磨机中研磨约50g实验室样品以通过0.5mm筛。

将所有材料转移到广口塑料罐中，通过摇动和倒置混合均匀。

对于固体潮湿的产品，如巧克力，温热至室温（约22℃），并用奶酪刨丝器将材料碾碎。

对于软的，非常潮湿的食物，如低脂酱，加热材料直到它变软；然后用抹刀剧烈搅拌，并取一部分代表散样。

对于液体或半液体产品，如果汁或酸奶，在加热前将pH调节至约6.5。

可以直接稀释在马来酸盐缓冲液中，C（a）。

（b）果糖标准工作溶液。

加入0.2 mL果糖标准储备溶液[1.5 mg/mL，C（k）]至0.9mL乙酸盐缓冲液，C（B）。

并彻底混合。

将0.2mL等份的该溶液（含有54.5μg果糖）一式四份分配到4个玻璃试管，B（M）。

加入0.1 mL乙酸盐缓冲液每管，C（b）。

在反应之前立即用沸水浴，加入5.0 mL PAHBAH工作试剂中，C（c）。

（c）试剂空白。

转移0.3mL乙酸盐缓冲液，C（b）。

进入试管并进行E（c）的标准试验。

（d）蔗糖对照面粉。

含有10％蔗糖。

按照与含有0-12%果聚糖的试验材料相同的程序分析1.0 g这种粉末。

本品不含果聚糖，用于检查蔗糖酶和硼氢化钠处理的效果。

计算出的果聚糖含量不应超过0.3%。

E.定量（a）果聚糖的提取。

（1）含有0-12％果聚糖的样品，运行D-果糖工作标准溶液（一式四份），试剂空白（一式两份），果聚糖对照面粉和蔗糖对照面粉各组试验。

利用试剂空白将分光光度计归零。

（i）将1.0g测试部分准确称入干燥的200mL烧杯中。

在~80℃加入80mL 热蒸馏水：搅拌并加热烧杯，用磁力搅拌器在~80℃下加热加热板约15分钟直至固体完全分散。

溶液浆液的pH值> 5.5。

果聚糖可以部分解聚。

（ii）将溶液冷却至室温，定量转移至100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度线，并混合。

（iii）通过纸过滤等分的溶液试样,B（h）。

并立即分析。

滤液可能略微混浊。

这不是问题。

（如果滤液在分析前在低温下储存数小时，则可能会沉淀出溶液。

在这种情况下，将溶液再加热至~80°C并冷却至室温，然后取出溶液进行分析。

）（2）含12-50％果聚糖的样品。

运行D-果糖工作标准溶液（一式四份），试剂空白（一式两份）。

果糖对照面粉和蔗糖对照面粉与每组测试样。

使用试剂空白将分光光度计归零。

（i）准确称取90-100 mg磨碎试料，直接放入100 mL耐热玻璃烧杯中。

在〜80°C下加入40毫升热蒸馏水，用〜80°C的磁力搅拌器搅拌烧杯并加热其内容物约15 min，直到固体完全分散。

溶液或浆液的pH值大于5.5，或果聚糖可能部分解聚。

（ii）将溶液冷却至室温，定量转移至50mL容量瓶中，用蒸馏水调节体积，并彻底混合内容物。

将等分试样的溶液过滤到反应管中B（h）,并立即分析。

（3）含有50-100％果聚糖的产品。

按照（2）进行，将溶液转移到100mL 容量瓶中并调节至标记。

通过纸张过滤等分的溶液，B（h），并立即分析。

（b）去除蔗糖，淀粉和还原糖。

（1）将0.2mL要分析的滤液（含有约0.1-1.0mg/mL果聚糖及对照样）转移到2个玻璃试管的底部。

B（m）。

（2）加入0.2mL稀释的蔗糖酶/淀粉酶溶液,C（g），到每管，在40℃下反应30分钟。

（3）加入0.2mL碱性硼氢化物溶液,C（e）, 到每个管。

剧烈搅拌管，在40℃下反应30分钟，完全还原为糖醇。

（4）加入0.5mL乙酸,C（f）, 到每管。

在涡旋混合器上对每个管进行剧烈涡旋。

如果硼氢化物是新鲜的，应该会观察到剧烈的反应。

如果没有，硼氢化物存在问题，改用新鲜的硼氢化物分析。

（此处理可去除过量的硼氢化物并将pH 调节至约4.5。

）。

这是溶液A.（c）果聚糖的水解和测定。

（1）将0.2毫升等份溶液A（一式两份）转移到玻璃试管。

B（m）。

（2）加入0.1毫升果聚糖溶液，C（h），到每个试管中，在涡流搅拌机上搅拌内容物，并在40℃下反应20分钟，使果聚糖完全水解为果糖和葡萄糖。

（3）向所有试管中加入5.0 mL PAHBAH工作试剂，包括果糖标准工作液，D（b），试剂空白，D（c）和果聚糖对照样品C（i）和蔗糖对照样品C（j）的提取物，并在沸水浴中反应恰好6分钟。

（4）从沸水浴中取出所有试管，立即置于冷水（18-20℃）中约5分钟。

（5）冷却后尽快测量410nm处所有溶液对试剂空白的吸光度。

PAHBAH颜色复合物会随着时间的推移而褪色。

在室温下，在10-15分钟内几乎没有变化（<5％）。

标准溶液也会出现同样的变化。

F计算计算总果聚糖含量（%。

如下：式中，A=0.2 ml反应溶液的吸光度相对于试剂空白读取；F=将吸光度值转换为ug果糖的系数（=54.5 ug果糖/54.5 ug果糖的吸光度值）；5 =将测定的0.2mL 转化为1.0mL的因子; V =所用提取剂的体积（mL）（100或50mL）; 1.1 / 0.2 =从1.1mL酶消化物中取出0.2mL用于分析；W =提取的测试浓度的重量（mg）；100 / W =以面粉重量的百分比表示果聚糖的因子；1/1000 =从ug转换为mg的因子；62 / 180 =从游离果糖转化的因子，已测定的脱水葡萄糖（和脱水葡萄糖），是在果聚糖中发生的。

G.指示性控制指示性对照用于检测测定条件。

蔗糖/α-纤维素材料的最终吸光度应非常低（<0.03）。

这证明了蔗糖酶处理步骤和硼氢化物还原步骤的有效性。

如果蔗糖未被蔗糖酶处理完全水解，则其将被果聚糖酶混合物水解并产生错误的高果聚糖值。

可以使用其他指示性对照，例如可溶性淀粉和α-纤维素。

来自α-纤维素的吸光度应该是可忽略的。

即<0.001；对于可溶性淀粉。

吸光度应该是非常低，即<0.03。

淀粉的这一结果证明了硼氢化物还原步骤的有效性。