实验二传代细胞培养与病毒在传代细胞中得培养一. 实验目得了解倒置显微镜得构造与使用，了解不同传代细胞得形态及接毒后得病变特 征,掌握细胞得传代培养方法、病毒接利方法及收毒方法。

二、常用细胞得种类BHK-21:仓鼠肾传代细胞PK-15：猪肾传代细胞IBRS-2:猪肾传代细胞Hela ：人得子宫瘤细胞Ver 。

：非洲绿猴肾细胞Marc-145:来源于Vero 细胞TK-143:人得胸昔激酶阴性细胞Sf9：昆虫细胞三、材料1、lOOml 细胞瓶、吸管、吸球、96孔细胞培养板、加样器、枪头BHK-21 (baby hamster kidney)细胞生长液:含10%犊牛血清、200U/inl 青、链霉素得DMEM 2、 3、 0、25%胰酶4、维持液:含2-5%犊牛血清、200U/inl青、链霉素得DMEM5、伪狂犬病病毒液(PRV)四.传代细胞培养得条件要求1)细胞密度:2-3X105个/ml2)pH 范围最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-3(rC五、常用细胞分散剂与作用原理1、胰酶使精氨酸或赖氨酸得竣基与其她氨基酸得氨基之间得多肽链发生水解, 导致细胞间质水解而使细胞或组织块消化为分散得单个细胞。

2、乙二胺四乙酸二钠(EDTA):与二价钙、镁离子结合■从而使细胞分散。

3、灰色链丝菌酶川I灰色链丝菌提取得一种酶制剂,就是蛋口酶、氨肽酶与竣肽酶得混合物。

六、营养液1、人工综合营养液氨基酸、糖类、无机盐类、维生素、辅酶、嚓吟、陀唏、辅助生长因子。

2、血清1)血清得种类胎牛血清、新生犊牛血清、成年牛血清、马血清、鸡血清、兔血清、羊血清、人血清，其中以新生犊牛血清使用最为广泛。

2)血清得处理无菌采集■过滤除菌。

用前56°C灭活SOmino 3）血清得作用A、能提供细胞生存.生长与增生所必须得生长调节因子。

B、能补充基础培养液中没有或量不足得营养成分。

C、含有一些可供贴壁依赖型细胞在培养器皿表面贴附与铺展得生长基质成分。

D、有中与毒性物质保护细胞不受伤害得作用。

E、给培养液提供ft好得缓冲系统。

F、提供蛋白酶抑制剂/呆护细胞免受细胞释放得蛋口酶得损害。

4）应用血清存在得问题A、血清中存在不少有害于细胞生长与繁殖得物质:补体、免疫球蛋白、生长抑制因子。

B、血清得成分不明确,影响对结果得分析。

C、不同动物、不同批次得血清成分与活性差别较大，使得培养结果不稳定。

七.传代细胞系培养1、优点：1）可以无限得传代。

2) 不少细胞系对病毒很敏感。

3) 某些传代细胞系能在悬浮培养条件下培养，适合病毒抗原得大量生产。

4) 生长旺盛，繁殖快速,对营养条件不苛刻。

2、缺点:在传代过程中遭到支原体与病毒得污染。

3、培养方法1）取长满单层得细胞一瓶,倾去培养液。

2）加入2inl胰酶消化液，于37°C培养箱放置儿分钟,至细胞间出现空隙或细胞变圆后,倒去消化液。

3）加入生长液,反复吹打儿次，使细胞分散成单个细胞，然后分装于3个小瓶中。

再在每个小瓶中补充生长液至lOml,然后置37C培养箱培养，培养1-2天即可长成单层。

八.病毒（PRV）在传代细胞中得培养1、选长满单层得细胞,倒掉培养液。

2、加入适量得病毒悬液3、置温箱中感作（吸附）45min-lho4、取出瓶子,倒掉或不倒掉培养液，补足维持液，置温箱中继续培养，直至80%以上得细胞病变。

5、收毒:将病变得细胞置于-2（rc冰箱中，冻结后取出自然解冻，在解冻过程中振摇儿次，以使细胞完全从瓶壁上脱落。

然后将病毒液收集于盐水瓶或其它容器中。

低温贮藏备用。

实验三.原代细胞培养（以鸡胚成纤维细胞为例）一、实验目得了解不同原代细胞得形态,掌握鸡胚成纤维细胞得制备与培养方法。

二材料1、9-11日龄鸡胚2、照蛋灯与蛋座3、碘酊棉球与酒精棉球4、大剪子、眼科剪、小银子5、平皿、细菌瓶、吸管、吸球、细胞瓶、6、胰酶、生长液、维持液三、细胞培养得条件要求1)细胞密度原代细胞:4-6X10'个/ml 传代细胞：2-3X10'个/ml2)pH 范圉最适 pH7、0-7、4,耐受 pH6、6-7、83)培养温度哺乳动物细胞一般为37°C昆虫细胞28-3(rC四.操作步杯1、取9-12日龄孵育&好得鸡胚，依次用碘酊与酒精消毒气室部。

2、无菌操作下用剪子去除气室部卵壳，去除壳膜，穿破绒毛尿粪膜，夹住鸡胚颈部, 取出鸡胚放于灭菌平皿中。

3、用眼科剪、银去除鸡胚头.四肢及内脏，用DMEM冲冼2次。

4、将冲洗后得鸡胚用剪子充分剪碎，使其近于乳糜状。

5、将剪碎得组织块倒入锥形瓶或烧杯或大青霉素瓶中，用DMEM充分冲洗,并静置儿分钟，待组织块下沉,吸弃上层液体，再加DMEMo如此反复冲洗2-3遍。

6、于沉淀组织块内加入约4倍量得0、25%胰酶，并调pH至7、6-7、&振荡混匀后置37°C水浴中感作30分钟，每10分钟轻轻摇动一次，使细胞消化完全（组织块变散松,沉降渐变缓慢时即表示消化足够）。

7、取出，静置儿分钟，小心吸弃上层胰酶溶液，用DMEM轻洗2次后，加入生长液5ml,用大口径吸管反复吹打,使细胞游离。

8、静置儿分钟,使未消化好得组织块下沉。

9、细胞计数取细胞悬液0、5ml+2ml0. 1%结晶紫一枸椽酸（0、Imol/L）溶液,室温或37°C 温箱中5-lOinin,充分振荡后进行计•数。

按口细胞计数法计算4角4个大方格内得细胞总数（N）。

每ml悬液中得细胞数（n）=N/4X10000XK（稀释倍数）。

活细胞数应在90%以上。

10、将计•数好得细胞稀释到合适得浓度,使细胞量约为4-6X10&个/ml,分层于细胞培养瓶中，每瓶Iml,再补加DMEM生长液至lOml,盖上盖子，置于37°C 恒温箱中培养。

五.结果得观察于培养后每天观察结果,至长层单层。

细胞量较大时，一天即可半:成单层，细胞呈纤维状。

：靈需实验四病毒感染力得滴定（Tcn）5。

得测定）一.实验目得了解病毒感染力测定得儿种常用方法,掌握半数细胞培养物感染量TCID旳得操作步骤、计算方法及含义。

二、测定病毒感染力得方法半数致死量LD“( 50% lethal dose):用动物或鸡胚来检测半数鸡胚感染量EIDso(egg 50% infective dose):用鸡胚来检测半数细胞培养物感染S TCIDso(50% tissue culture infective dose):用细胞来检测蚀斑形成单位(plaque forming unit, PFU):用细胞来检测三、材料1、长满单层得细胞1瓶 2、胰酶、吸球、吸管、生长液 3、96孔细胞培养板 4、加样器、枪头 5、病毒液(PRV)四.TCIDo得操作步骤1、在青霉素瓶或离心管中将病毒液作连续10倍得稀释，从10"-10"%2、将稀释好得病毒接种到96孔微量培养板中，每一稀释度接种一纵排共8孔,每孔接种lOOWo3、在每孔加入细胞悬液loom,使细胞量达到2^3X10^个/ml。

4、设正常细胞对照，正常细胞对照作两纵排。

(100M1生长液+100M细胞悬液)5、逐日观察并记录结果，一般需要观察5-7天。

6、结果得计算，按Reed-Muench两氏法或Karber法五、TCI九得计算方法CPE:细胞病变效应1、Reed"Muench 两氏法距离比例=（高于50%病变率得百分数-50%）/（A-于50%病变率得百分数-低于50% 病变率得白分数）= (91、6-50)/(91、6-40)=0、8IgTCIDso^距离比例X稀释度对数之间得差+高于50%病变率得稀释度得对数=0、8X(-1) +(-3) =-3、8TCID5O=1O"^'V O. Iml 含义:将该病毒稀释lO’r接种loom可使50%得细胞发生病变。

2. Karber 法IgTCID沪L-d(s-O、 5)L:最高稀释度得对数D:稀释度对数之间得差S:阳性孔比率总与IgTCIDso—l-lX (3、375-0> 5)=-3、 875TCIgFlCr'E/O、Iml 含义:将该病毒稀释10'、接种loom可使50%得细胞发生病变。

实验五血清中与试验-X实验目得了解中与试验得基本原理与儿种不同得测定方法•掌握固定病毒一稀释血清法得操作步骤与计算方法及含义。

二.原理抗体与相应得病毒粒子特异性地结合，使病毒得感染力丧失。

三、用途 1、疾病诊断 2、病«分离株得鉴定 3、不同病毒株得抗原关系研究 4、疫苗免疫原性得评价5、免疫血清得质量评价6、测定实验动物血清中就是否存在抗体四.分类（-）蚀斑（痘斑）减数试验将病«-正常血清混合物以及病毒一待检血清混合物分别接种到单层细胞上，随后覆盖营养琼脂或甲基纤维素，进行蚀斑测定上匕较病毒一正常血清组与病«-待检血清组产生得蚀斑数，两者得差数表示待检血清得中与能力。

以试验组得蚀斑数比对照组减少50%作为判定依据，血清稀释度就就是其蚀斑减数试验效价。

（二）交义保护试验先将实验动物进行主动免疫或被动免疫，然后以待检病毒进行攻击■根据实验动物被保护得情况，判定待检V得种类或型别。

这一方法得缺点就是试验周期太长,并且需要大量得实验动物。

可用于以下儿方面:应用已知V鉴定未知V;应用已知免疫血清鉴定未知V;应用已知V鉴定未知血清。

（三）终点法中与试验 1、固定病毒一稀释血清法将不同稀释度得血清与固定量得病毒液（一般为100或200个TCIDso. EIDso 或LDso）混合，置适当得条件下感作一定时间，再将血清-病毒混合物接种于敏感细胞、鸡胚或实验动物•测定被检血清阻止组织培养细胞、鸡胚或实验动物发生病毒感染得能力及其效价。

以能保护50%组织培养细胞、鸡胚或实验动物不发生病变、感染或死亡得血清最高稀释倍数，作为该血清得50%中与效价（PD5O）O 2、固定血清一稀释病毒法在固定量得血清中■加入等量不同稀释度得病毒■用对照非免疫血清（对照组）与待检血清同时进行测定•讣算每一组得TCID5O>EID SO或LD SO,然后计算中与指数。

五.材料长满单层得细胞1瓶2、胰酶、吸球、吸管、生长液3、96孔细胞培养板4、加样器、枪头5、病毒液（PRV）6、待检血清.PRV阳性对照血清、PRV阴性对照血清六、操作步骤lx固定病毒一稀释血清法1）测定病毒液得TCID旳2）将测好TCIB。

得病毒液稀释成200个TCIB。

得病毒悬液。

3）在96孔微量培养板中将血清（预先569灭活30min）作连续倍比稀释（具体方法就是在96孔板中先加入50m生长液，再加50M1待检血清,混匀后，吸50M1至下一孔，如此下去。