第三章 生物材料的预处理、 细胞破碎和液－固分离
第一节 生物材料的预处理
生物活性物质不论在胞内胞外，浓度通常都 很低，杂质含量却很高，生理活性越高的成分其含 量往往越低。即使通过现代生物技术，目的物含量 提高，前期处理液中也会含有大量的菌体细胞、色 素、金属离子以及其他代谢物质等，需进行预处理 去除大部分杂质，提高分离纯化的效率。
（5）等电点沉淀： 与其他方法合用以增加沉淀效果
（6）加各种沉淀剂沉淀： 与蛋白质形成各种复合物沉淀。阳离子
或酸根离子
2．多糖的去除 含较多多糖，黏度增加，液固分离困难 加入酶：将多糖转化为单糖；
加入阳离子表面活性剂：CTAB,CPC 3.高价金属离子 离子交换法 沉淀法
钙－草酸；镁离子－草酸，磷酸盐；铁离子－黄血盐
3.PH：合适的PH有助于提高离子型絮凝剂功能团的电 离度，从而使链分子上同种电荷间的排斥作用增大， 链从卷曲状态到伸展状态，发挥最佳架桥能力
4.操作条件：刚加入絮凝剂时增加搅拌速度可使之迅 速分散；絮凝团形成后快的搅拌会打碎絮凝团
（3）变性沉淀 加热、大幅度改变PH、加入有机试剂、
重金属盐、表面活性剂等
激活方法：提取前加入活化剂和保护剂，激活后再分 离纯化；先以酶原的形式初步提纯，再加入激活剂 等活化，再分离提纯
2．后续操作的要求 不同的提取工艺路线，对预处理和固－液分
离后的滤液的要求液不一样。 离子交换
对无机离子、灰分含量、澄清度方面要求严格 溶剂萃取
蛋白质含量低，减轻乳化现象 直接沉淀法
（1）加入凝聚剂
（2）加入絮凝剂 （3）变性沉淀 （4）吸附 （5）等电点沉淀 （6）加各种沉淀剂沉淀
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
（1）加入凝聚剂 原理：在某些电解质作用下，使胶体粒子的扩散双电层
的排斥电位降低，破坏了胶体系统的分散状 态，而使胶体粒子聚集的过程。（凝聚作用） 方法：加入无机盐使细胞、细胞碎片和蛋白质等胶体颗 粒发生凝聚作用而被去除 影响因素：无机盐的种类、化合价及无机盐的用量等。
（4）吸附
加入吸附剂（活性炭等）；
加入反应剂，利用它们相互反应生成的沉淀物来 吸附蛋白质，使其凝固。如：在枯草杆菌的碱性 蛋白酶发酵液中，利用氯化钙和磷酸盐生成磷酸 钙盐的反应来除去杂蛋白和菌体等；四环素发酵 液中加入黄血盐和硫酸锌，生成亚铁氰化锌钾 K2Zn3[Fe(CN)6]2的胶状沉淀，能将杂蛋白质和菌 体等黏附在其中而除去
二．动物材料的预处理 绞成组织肉糜： 先粗后细反复多次；冰冻状态下直接切块绞 匀浆: 玻璃匀浆器、组织捣碎器；高压匀浆器 反复冻融； 制成丙酮粉
匀浆机
三．细胞培养液的预处理 目的： 除去可溶性黏胶状物质
如核酸、杂蛋白、不溶性多糖等； 除去某些无机盐，特别是高价金属离子
1．细胞及蛋白质的处理
1、化学试剂处理
2、冻融
2、酶解法
3、渗透压冲击 3、制成丙酮粉
一．机械法 基于细胞与设备中的固体表面间的相互作
用产生的剪切力 高压匀浆器、高速珠磨机、超声波振荡器
高压匀浆器
高速珠磨机
超声波振荡器
二．物理法
干燥法：菌体干燥后，其细胞膜的渗透性发生变 化，同时部分菌体会产生自溶，然后用丙酮、丁醇 或缓冲液等溶剂处理，胞内物质就会被抽提出来。
高价阳离子效果好 水合硫酸铝，水合氯化铝，氯化铁，硫酸锌，碳酸镁
（2）加入絮凝剂 原理：絮凝剂是一种长链状结构的有机高分子
化合物，易溶于水，其分子量可达数万到一千万以 上，在长链上含有相当多的活性功能基团，可强烈 吸附胶体悬浮液中的胶粒；而且其含有许多链节， 可分别吸附在不同的颗粒表面，产生架桥联接，形 成粗大的絮凝团沉淀出来，有助于过滤。
发酵液加草酸、净化剂、复滤、脱色
3．目的物稳定性
分离纯化过程中，目的物的生理活性处于不断 变化中，所以要把防止目的物失活放在首要！对酶 类药物的提取要防止辅酶的丢失和其他失活因素的 干扰；对蛋白质类药物要防止高级结构的破坏，即 变性作用；多肽及核酸类药物需注意酶的降解作用； 对脂类药物应特别注意防止氧化作用
（絮凝作用）
分类：阴离子型、阳离子型、非离子型 常用：壳聚糖、海藻酸钠、明胶、酰胺类衍
生物、聚苯乙烯类衍生物、聚丙烯酸类等 影响因素： （1）絮凝剂的分子量： （2）絮凝剂的用量： （3）溶液pH值： （4）搅拌速度和时间
1.絮凝剂的分子量： 大，链长，吸附架桥效果明显； 但降低溶解度
2.用量： 浓度低： 增加用量有助于架桥，提高絮凝效果； 浓度高： 过多会引起吸附饱和，在胶粒上形成覆盖层而失 去与其他胶粒架桥的作用，使胶粒更加稳定
反复冻融法：将细胞在-15度左右冰冻，室温融 解，反复几次，由于在冷冻过程中会使细胞膜的疏 水键结构破裂，从而增加细胞的亲水性能；细胞内 冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，而 使细胞结构破碎。
渗透压冲击法：先把细胞放在高渗溶液中， 由于渗透压作用，细胞内水分向外渗出，细 胞发生收缩，当达到平衡后，将介质快速稀 释或将细胞转入水或缓冲液中，由于渗透压 发生突然变化，胞外的水分迅速渗入胞内， 使细胞快速膨胀而破裂，使产物释放到溶液 中。
第二节 细胞破碎
不同的生物体或同一生物体的不同部位的组 织，其细胞破碎的难易不一，使用的方法也不相 同，如动物脏器的细胞膜较脆弱，容易破碎，植 物和微生物由于具有较坚固的纤维素、半纤维素 组成的细胞壁，要采取专门的细胞破碎方法。
一、机械法 1、匀浆法 2、珠磨法 3、超声波
二、物理法
三、化学法
1、干燥
三．化学处理法 1．加入化学试剂：
化学试剂处理可以通过改变微生物细胞细胞膜/ 壁的通透性来溶解细胞或者抽提某些细胞组分，从而 使内含物有选择性地渗透出来 （1）用酸碱处理细胞： 溶解除去细胞壁以外的大部分组分； 调节溶液PH－改变细胞所处环境－改变蛋白质的带 电性质－蛋白质之间或蛋白质与其他物质之间的作用 力降低－易于溶解到液相，便于后面的提取
一．确定预处理方法的依据 1．生物活性物质存在方式与特点
胞内：合成酶系，遗传物质，代谢中间产物， 如DNA聚合酶，CytC等 破碎细胞，结合于质膜或器膜上的，要选择
适当的溶剂使之溶解下来。 胞外：消化酶系，毒素，代谢终产物
注意：胰蛋白酶、糜蛋白酶等消化酶虽可以分泌到胞 外，但难以从消化道收集，一般都由相应腺体提取 分离。而且其在细胞内刚合成时是以无活性的酶原 形式存在的，提取时需预激活。