实验四病理组织切片制作一、实验目的组织切片技术是病理学中不可缺少的一个组成部分。

通过实验，能够使学生了解和掌握病理组织切片的基本方法之一，即石蜡包埋的组织切片法。

二、实验原理根据病变及检查的要求，合理采集病料，经固定、脱水、透明、浸蜡、包埋后进行切片，在进行染色得到结果。

固定是用化学药品把组织原来的结构保存下来，以便观察。

脱水是除去组织中的水分，以利于透明和浸蜡。

组织的透明是便于透蜡包埋。

包埋的是使石蜡透入组织内部，把软组织变为适当硬度的包埋块，以便切成薄片。

最后使用切片机，将包埋块中组织切成薄片。

三、主要仪器及试材已固定好病料，石蜡，手术刀，手术剪，镊子，脱水框，染色缸，梯度脱水酒精和透明剂一套，烘箱，切片机，毛笔，玻片，蛋白甘油，染色架，酒精灯，三角架，大烧杯，温度计，火柴，切片刀，记号笔或铅笔。

四、实验方法与步骤。

（一）固定采取的病理材料必须立即放入10％福尔马林固定液中。

（二）脱水组织经固定后，尚含有多量水分，而水与透明剂苯、石蜡根本不相融合。

必须先把组织中的水分除去。

但脱水剂必须是与水在任何比率下均能混合的液体，脱水剂常兼有硬化组织的作用。

最常用的脱水剂为酒精、丙酮等。

1．酒精沸点78．4℃，为最常用的脱水剂。

脱水能力强，并能使组织硬化，能较好地与二甲苯透明剂相混合。

最终结果表明，只要脱水环节处理好，都会得到好的切片。

脱水的程序为70％一80％一95％一100％。

各级酒精2—4小时，视材料的大小、厚薄而定。

100％酒精有硬化组织的作用，时间不宜太长，一般不超过3小时。

脑组织、脂肪组织或疏松结缔组织，脱水时间要适当延长。

2．丙酮沸点为56℃。

脱水作用比乙醇强，但对组织块的收缩较大，主要用于快速脱水或固定兼脱水。

脱水时间l一3小时左右。

（三）透明透明对组织有脱酒精及透明两种作用。

当组织中全部为透明剂占有时，光线可以透过，组织可呈现不同程度的透明状态，此种现象称为透明，具有这种作用的试剂称为透明剂。

常用的透明剂有：1．二甲苯是最常用的良好透明剂，不影响各种染色。

二甲苯易溶于酒精，能溶解石蜡，也是封固剂，不吸收水，透明能力强，易使组织收缩、变脆，故组织块在二甲苯中不宜久留，特别对小动物组织材料必须严格控制好(各种器官的透明差异很大)，通常为半小时到1小时左右。

当二甲苯透明时必须持组织放在专用二甲苯皿器中，这样可减少透明时间，有利于组织透明彻底，在换组织块透明时候，所用的镊子等器具必须干燥，不得将水滴混入二甲苯中，因水滴易被组织吸收而影响透明程度，潮湿天气更应引起注意。

2．冬青油（水杨酸甲酯）为无色油样液体，易溶于醇、醚及冰醋酸，难溶于水。

透明速度较慢，数小时或数天。

一般经无水乙醇脱水后再入冬青油。

（四）浸蜡（透蜡）组织经脱水透明后要用石蜡等支持剂透入内部，并除去组织中的透明剂，把软组织变为适当硬度的蜡块，以便切成切片。

浸蜡的要点有二：①石蜡要完全渗入细胞的每个部分：②石蜡要紧密而均匀的贴在细胞内外两面，使组织与石蜡成为不可分离的状态。

为了减少组织的收缩和提高浸蜡的效果，浸蜡用的石蜡依据熔点不同，先经低熔点石蜡再经高熔点石蜡。

一般设置熔点50—52℃为第一缸蜡，52—54℃为第二缸蜡；54—56℃为第三缸蜡，第三缸石蜡的熔点根据季节可进行调节，夏天使用熔点56—58℃或58—60℃石蜡，盛夏使用熔点60—62℃石蜡。

浸蜡的时间根据不同组织类型及其大小而定：组织1—2cm大小，浸蜡2—3小时，2—3cm浸蜡3—5小时，对细胞密集，纤维成分少，如肝、肾应减少时间，含脂肪和纤维成分较多的组织需增加时间。

浸蜡时石蜡在温箱内的温度应与石蜡的熔点相配合，温度不可过高过低，过高会使组织高度收缩变脆，无法切片，过低石蜡将凝固达不到浸蜡的作用。

常规的作法是调节至略高于石蜡熔点2—3℃。

控制温度是浸蜡极其重要的关键。

（五）包埋将液态的石蜡倒入金属包埋框或包埋的纸盒中，再将浸好蜡的组织块平放底部，注意切面方向朝下放置，待石蜡凝固后去掉包埋框，完全冷却变硬后再修整蜡块，要求组织外围的石蜡保留适中以便切片。

（六）切片前的准备工作1．修整蜡块石蜡切片是以石蜡作为组织的支持媒介。

应先将包埋的每块组织周围过多的石蜡切去，四周留约2mm的石蜡边。

留得过少，使连续切片分片困难且易破坏组织；留得过多，徒占地方，同时使标本之间的距离过远而镜检不便。

蜡块两边必须切成平行的直线，否则切下的蜡条弯曲，也不可修成圆角，致蜡带容易分开不能成条。

2．玻片处理一般玻片用76X26mm载片，厚度l一1．5mm，厚于1．5mm的玻片不宜用于高倍镜及油镜的观察，选购玻片应注意：从侧面看白色的为优品，带蓝或绿色的为劣品，平面光滑不带波纹者为上品，稍有波纹者为次品，边缘光滑己加工磨边者为上品，边缘粗糙未经磨边者为次品。

载玻片上面如有云雾斑点，系受霉菌侵蚀不能使用。

新的玻片也必须擦洗干净，否则染色时引起切片脱落，方法有①煮沸洗涤法、②洗液浸泡法。

最后经95％酒精浸泡脱脂、烘干。

将洗净的载玻片上均匀涂抹薄薄的一层蛋白甘油(防止组织脱片)，放置冰箱备用。

（七）切片制作过程1．将预冷的蜡块固定在石蜡切片机上，使蜡块的切面与刀口成平行方向，刀的倾斜度通常为15℃，转动轮转推进器，调节切片厚度为6μm，切成厚度均匀的切片。

2．左手持毛笔，右手旋动切片机转把，切片带出来之后，用毛笔轻轻托起，再用眼科镊轻镊蜡片，以正面放入展片箱中，其水温40—43℃左右。

待摊平整后捞片。

3．贴附切片左手持载玻片之一端，垂直入水去附贴切片，右手用毛笔辅助推动，附贴至玻片上的三分之二处。

4．切片贴附后，放在空气中稍晾干，即可进行烤片。

血块组织、皮肤组织须及时烤片。

但对脑组织、脂肪组织待完全晾干后才能进行，这样可防止产生气泡而影响染色。

烤片的温度以蜡溶解为准。

也可以放置60℃烘箱内烘烤过夜。

五、实验注意事项1．固定组织所用的固定液要充足，至少相当于标本总体积的5倍以上，标本容器及其口径有适当大小，使标本能原形进行固定，避免使标本遭受挤压。

2．组织块透明在制片中是很重要的环节，如果组织不能透明，其原因可能有脱水未尽、组织太厚、透明时间不够以及与某些组织本身性质有关等。

所以应从多方面考虑，尽可能使组织达到透明目的。

通常根据透明时间与眼观相结合判断透明程度。

3．凡是陈旧、腐败或干枯的组织不易制成好切片。

4．固定失时或固定不当的组织，染色时常出现核染色质着色浅、轮廓不清，出现程度不等的片状发白区。

5．组织脱水、透明和浸蜡过度，会造成组织过硬过脆，特别是小动物组织应严格控制。

6．切片刀不锋利，切片时会自行卷起或皱起，不能顺利连成长蜡带。

切片刀有缺口，易造成切片断裂、破碎、不完整及刀痕等现象，不利于切片和观察。

7．组织切片机各个零件和螺丝应旋紧，切片刀应固定牢固，否则将会产生震动，以致出现切片厚薄不匀和横皱纹等现象。

六、实验结果处理每人切出4-5张良好的切片。

一、实验目的任何切片，不经过染色，在显微镜下只能看到细胞和组织的轮廓，远不能满足观察和诊断的目的。

染色是将染料配制成溶液，将组织切片浸入染色剂内，经过一定时间，使组织和细胞的成分被染上不同的颜色，产生不同的折射率，便于在光学显微镜下进行观察。

因此，染色在组织形态学、病理学诊断、研究工作中，具有非常重要的实用价值。

二、实验原理染色是染色剂和组织细胞的结合过程。

使用不同的染色方法，其原理有差别。

苏木素伊红染色法为病理组织切片最常用的染色方法。

由于它对组织细胞的各种成分都可染出，便于对组织成分的全面观察，且以任何固定液固定的材料，各种切片法都可适用。

用H．E染色的标本，不易褪色可以长期保存。

在常规的苏木素伊红染色中，苏木素经过氧化变成酸性染料苏木红，而苏木红和铝结合形成一种带正电荷的蓝色色精，带正电荷的蓝色色精和带负电荷的脱氧核糖核酸酸根，通过正、负电荷的极性吸着来完成结合，使细胞核染成蓝紫色。

伊红是一种酸性红色胞浆性染料，它们的染色可能是通过渗透作用或弥散作用而完成的，使细胞浆染成红色。

三、主要仪器及试材HE染色全套试剂，染色缸（卧式），摊片盘，搪瓷缸，盖玻片，中性树胶，牙签，显微镜。

四、实验方法与步骤常规石蜡切片H．E染色程序(一)脱蜡至水1．二甲苯Ⅰ 5-15分钟2．二甲苯Ⅱ 5-15分钟3．无水乙醇 3分钟4．95％酒精 3分钟5．80％酒精 3分钟6．70％酒精 3分钟7．自来水洗(二)染色1．Harris苏木素液 5-7分钟2．自来水洗 5分钟3．1％盐酸溶液分化 30秒4．自来水洗 5分钟5．1％氨水返蓝 10秒6．自来水洗 15-20分钟7．95％酒精 3分钟8．1％伊红酒精溶液 1-2分钟(三)脱水、透明和封固l．95％酒精 2分钟2．无水酒精Ⅰ 2分钟3．无水酒精Ⅱ 2分钟4．二甲苯Ⅰ 5分钟5．二甲苯Ⅱ 5分钟6．中性树胶封固结果：细胞核呈蓝色，细胞浆呈红色。

五、实验注意事项1．任何石蜡切片必须经过二甲苯进行脱蜡后才能染色，石蜡切片要求平板烘干，以便组织与玻片粘贴牢固。

组织切片脱蜡的好坏，与二甲苯的温度及时间有关，二甲苯使用时间过长，应及时更换。

2．在H．E染色过程中，其成败的关键在于分化，如果分化不当致使应该分化脱色的部分末予脱去，或分化不足致染色不均匀，复染对也不能得到对比鲜明的色彩，另外流水冲洗时间的长短对组织返蓝色彩鲜艳与否也有一定的关系。

须要提及的是，染色的成败除染色技术以外，组织材料的过分陈旧或长期固定在甲醛中的组织，由于过度酸化都会影响染色；或组织固定不当，固定不足组织发生自溶等均会使染色模糊。

3．伊红染色后必须经梯度酒精脱水，特别需要经过无水乙醇，脱水一定要彻底，否则，影响透明。

4．脱水后，经二甲苯进行透明，才能封固。

透明应注意时间充足，才能达到良好效果。

封片时，中性树胶不能滴加太多或太少。

封固好的切片应平放在摊片盘上，及时放置于恒温箱中40-50℃烘烤15小时左右，有利于切片的保存。