1.2过氧物酶体(Peroxisome)：遍布于真核生物的细胞器中, 用来去除有 害物质. 它们用外表的单层膜与细胞的原生质分隔开来, 膜上有功能重要 的膜蛋白, 用以向细胞器中输入蛋白质和促进细胞分裂. 与溶酶体不同的 是, 过氧物酶体不是由分泌通路产生, 而是通过先涨大后分裂的自我复制 过程产生, 当然也有证据显示新的过氧物酶体可以直接产生. 过氧物酶体 是由比利时细胞学家德迪夫(Christian de Duve)在1965年发现的.
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3.4：ML，OL，及（b）SML 过氧化物酶体的生物合成三种 不同的培养条件下比较。 SML： 切换葡萄糖和甲醇进料。在过 氧化物酶体中使用GFP-SKL （YGLY31884）进行定量测定。 数据点表示在两个独立的运行 平均值。星号（*）表示甲醇阶 段
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3.5三种不同的工艺条件下（YGLY29325）发酵特性 - ML， OL和SML。 （一）细胞的密度分布（gWCW/ L）; （二）细胞列 解指数（毫克 DNA/ L）; （三）抗体效价（毫克/升）; （d） OL条件下延长诱导时间的细胞密度和抗体效价。
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• AOX1启动子是在ML最活跃下，但OL下不太活跃。
SML:甲醇培养20h用50%的葡萄糖15g/h的速度培养8h作为一个周期共培养3个周期 OL:甲醇进料保持反应器中甲醇1％，每当DO迅速增加，这表明甲醇消耗。 DO级联 被打开，关闭和搅拌速度 被减小到实现氧气的限制
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2.4 GFP表达的定量和可视化：
约107固定的酵母细胞经PBS洗后用mounting solution重悬制作切片用 Axioscope 2 Plus 显微镜来观察OpenLAB软件来实现相机控制和图像收 集Volocity软件用来量化GFP在细胞中的强度
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3.6 在甲醇补料阶段的代谢过程（a）甲醇限定（ML）（b） 氧受限（OL）条件下补料分批巴斯德毕赤酵母的培养。
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4结论与分析
在这项研究中，我们调查AOX1启动子和过氧化物酶体如何被调 节以响应碳源（例如甲醇）和氧气分子的可用性 在蛋白质生产阶 段，以更好地了解在毕赤酵母发酵常用的工艺条件。
酵母表达手册）
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2.3：补料分批培养条件
研究了三种不同发酵条件下的PpAOX1启动子（ YGLY29325 ）和过氧化物酶体 生物合成（ YGLY31884 ）的调控。
诱导阶段分批补料条件
ML:甲醇的起始供应速率为2.6gl/lh然后在0.0063.5抗体效价的测定
在培养上清液中于280nm处抗体浓度用二极管阵列检测器和蛋白A亲 和柱与HPLC系统
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2.6:细胞裂解
从毕赤酵母细胞释放细胞外的DNA使用 Quant-iT™ PicoGreen® dsDNA Assay Kit 双链DNA检测试剂盒检测
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3实验结果与讨论 3.1:
额外增加1%甲醇（OL）DO (%) ：
黑色直线，甘油或葡萄糖：蓝色,甲 醇:红色。细胞湿重：黑色三角
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3.3毕赤酵母AOX1启动子（YGLY29325）根据三种不同的补料分批条件规制 - 甲醇 -
限制（ML），切换与葡萄糖和甲醇（SML）和氧气限制（OL）补料分批条件。 （a）
通过荧光显微术 UB - R- GFP和GFP- SKL 被正确地定位于细胞 质和过氧化物酶体， 符合预期
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3.2:YGLY29325的三种不同的补料
分批发酵条件的取样数据(a) 甲醇
限制 (ML); (b) 葡萄糖培养8h甲醇 培养(20 h) (SML); (c) 氧气限制并
题目
Regulation of alcohol oxidase 1 (AOX1) promoter and peroxisom biogenesis in different fermentation processes in Pichia pastoris
毕赤酵母不同发酵进程中乙醇氧化酶启动子和过氧物酶体生物合 成 的调控规律
文章来源：Journal of biotechnology
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• 1背景介绍
• 2实验材料和方法
• 3实验结果
• 4结论与分析
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背景介绍
1.1醇氧化酶AOX1基因启动子作为甲醇诱导的强启动子,在Pichia pastoris表达系统生产重组蛋白中得到广泛应用。P.pastoris中的转录 因子通过特异的顺式作用元件与启动子相互作用而影响基因的转录,因此 通过调节AOX1基因启动子的活性可以控制下游基因的表达
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1. 3GFP-SKL（过氧化物酶体定位蛋白）,该载体含有融合了过氧化物酶体 定位信号1(PTS1)的绿色荧光蛋白报告分子GFP-SKL编码基因 成功地用于描 述不同 时间进程的AOX1启动子和过氧物酶体生物合成因素的特征
1.4泛素蛋白（细胞液中的短周期荧光蛋白）泛素(ubiquitin)是一种存 在于大多数真核细胞中的小蛋白。它的主要功能是标记需要分解掉的蛋白质， 使其被水解。当附有泛素的蛋白质移动到桶状的蛋白酶的时候，蛋白酶就会 将该蛋白质水解
GFP荧光表达图像（b）不同诱导时间的荧光蛋白相对密度。对于ML和OL，时间表示分
批阶段（T1），甘油补料分批阶段诱导前（T2）和诱导期（T3，10±2小时; T4中，
36±2小时; T5，62±2小时; T6，84±2小时）。对与SML条件下，细胞生长是在T2，T4
和T6 葡萄糖阶段，诱导是在T3和T5甲醇阶一段类荟萃
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二：实验材料和方法
2.1：质粒的构建
表达GFP- SKl pGLY11245或pGLY13173 转化YGLY27355或YGLY31884 YGLY14836生 产单克隆IgG1抗体
表达Ub-R-GFP pGLY10148转化 YGLY19309或YGLY29325 生产单克隆IgG1抗体 2.2：转化：毕赤酵母感受态的制备和电转化的方法（参见nvitrogen公司的Pichia