1）热灭活：主要作用在细胞质中，使核糖体16S亚 基或核糖体RNA受到损伤。
2）紫外线灭活：致死损伤部位主要在DNA位点上。 3）化学药剂灭活：使细胞代谢过程中的某些关键酶
不可逆的失活，导致原生质体即使在适宜的条件 下仍然不能再生。
3.3灭活的机理 3.4灭活原生质体特点与应用
• 灭活机制
• 目前对灭活原生质体的融合机制还不很清楚。
2）不能互补融合形成重组体的原因 因为紫外线的 作用位点主要在原生质体的 DNA 上，而且不同 的细胞中作用位置可能有很大差别，这样双亲株 原生质体用紫外线灭活或分别用紫外线和温度灭 活，融合后损伤可以互补，而双亲株都用热灭活， 可能在不同的细胞中作用位点差别不大。所以不 能互补融合形成重组体。
• 3）在单亲灭活原生质体融合中，有人认为可以实现遗传 物质的单向传递，被灭活亲株起供体作用。但是在双亲灭 活原生质体融合时，二亲株都以零或接近零的存活率被灭 活，仍可以相当高的频率形成重组体，说明灭活的原生质 体仍可以起到受体作用， 否则不能形成重组体。 因此认 为只有损伤互补才能较为圆满地解释灭活融合。
• 计算方法：常用的是血球计数板记数法。 • 原生质体形成率(% )=(酶解前的菌落数-酶解后的菌落数）
/酶解前的菌落数×100%。
3、灭活原生质体融合
3.1亲本及其遗传物质的标记选择
常用的有带隐性性状的营养缺陷性和抗性标记， 还有热致死（灭活），孢子颜色和菌落形态。目 前比较好的是灭活标记。
• 3.2常用的灭活标记方法：
原生质体融合技术的优点
1）可实现常规杂交方法无法做到的种间、属间、门间 甚至跨界的远缘杂交；
2）并可以大幅度提高亲本之间的重组频率，集中双亲 株优良性状的机会更大。
3）与常规杂交技术相比，原生质体融合时亲本整套染 色体参与交换,遗传物质转移和重组性状较多,集中双亲本 优良性状机会更大，为异源DNA片段交叉互换创造一个 优良的环境；
• 而且酶量过大会使细菌脱壁太彻底，失去了原生质体再生 时合成细胞壁的引物，易使菌体凝集，降低原生质体的再 生率。
酶解时间对原生质体制备的影响
• 充足的酶解时间是细菌原生质体化的必要条件，原生质体 形成率随酶解时间延长而增加，但再生率会由于随酶解时 间过长导致细胞壁脱壁彻底无法再生而降低。
• 原因可能是酶解超过某一临界值后，细胞壁消化过于充分 使细胞破裂或失去再生能力，从而导致再生率的降低再生 培养基的组分也是影响原生质体再生的一个重要因素。
• 因此要控制好原生质体制备时的酶解时间。
甘氨酸浓度对原生质体制备的影响
• 在培养基中添加一定浓度的甘氨酸培养后，易于使细胞壁 的网状结构松动，释放原生质体，可有效促进菌丝体细胞 壁形成对溶菌酶敏感的结构，提高制备的原生质体质量;
• 添加甘氨酸后，发酵液的状态也有所改变，菌丝结块、挂 壁现象减少，菌丝分散更加均匀。
酶解温度对原生质体制备的影响
• 不同的酶具有各自不同的最适温度，同时还要注意菌株生 长的最适温度，以避免因温度不当而导致原生质体活性降 低，甚至破坏，因此确定酶解温度通常要二者兼顾，这对 水解细胞壁是至关重要的。一般酶解温度控制在20~40度。
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酶浓度对原生质体制备的影响
• 原生质体形成率在一定范围内与溶菌酶的浓度成正比。当 浓度过高溶菌酶作用于原生质体时，形成率得到提高高， 但溶菌酶中往往含有一些对原生质体有害的酶类（如过氧 化物酶、核糖核酸酶等），因此，当达到一定浓度时，必 然会严重地影响原生质体的活性；
• 但过高的甘氨酸浓度会抑制菌体的正常生长而得不到足够 的菌丝体。
渗透压对原生质体制备的影响
• 原生质体对溶液和培养基的渗透压很敏感，必须在高渗透 压或等渗透压的溶液或培养基中才能维持其生存；
• 在低渗溶液中，原生质体将会破裂而死亡，对于不同的菌 种，采用的渗透压稳定剂不同。
2.3原生质体形成率的计算
4）大幅度提高亲本之间重组频率，扩大了重组的亲本 范围。
2、原生质体的制备
• 2.1 原生质体融合技术的过程
原生质体融合技术一般包括标记菌株的筛选、原生质体制备、培 养、融 合、再生, 原生质体转化等。
原生质体的制备首先要去除细胞壁,当前去壁的方法主要有机械法、 非酶法和酶法, 现在使用较多的为酶法。 • 2. 2 原生质体制备条件的确定 具体包括： 1）酶解温度； 2）酶浓度； 3）酶解时间； 4）甘氨酸； 5）渗透压； 6）菌龄；
原生质体融合技术
学号：11110010127 姓名：魏福静
原生质体融合技术
• 1、原生质体融合技术的发展 • 2、原生质体的制备 • 3、原生质体形成率的计算 • 4、灭活原生质体融合 • 5、原生质体融合的方法 • 6、原生质体融合技术应用与展望
1、原生质体融合技术发展简介
• 原生质体融合技术育种( protoplast fusion)是20世纪 70年代发展起来的基因重组技术。通过两个遗传性状不同 的亲株原生质体融合从而达到杂交目的。从1960年法国 的Barsi研究小组在培养两种不同动物细胞混合时发现了 自发融合现象到1979年匈牙利的Pesti提出了运用融合育 种技术提高青霉素的产量,原生质体融合技术的成熟使得开 始了在微生物育种实际工作中的应用。
灭活原生质体融合技术的特点
• 1）灭活原生质体融合，特别是双亲灭活原生质体融合， 省去了使出发菌株获得稳定遗传标记的过程， 灭活亲株 原生质体的方法又易于掌握；
• 2）可以在不利用选择培养基的情况下， 排除了双方亲本 类型的再生产物， 有利于选择重组融合子， 提高了筛选 效率。
• 1）Wright 的损伤互补原则 Wright使用不同的生化药 剂分别灭活两株动物细胞，融合后得到了活的杂交细胞， 他认为这是由于两株细胞的致死损伤得到了互补的结果。 Fodor等热灭活带有标记的 B.megaterium 的二个亲株原 生质体，经PEG 诱导后未获得融合子。李焕娄等在研究弗 氏链霉菌的株间灭活原生质体融合时发现，当两亲株的原 生质体分别用热和紫外线，或都用紫外线灭活，然后进行 融合，而两亲株都用热灭活时，未能获得重组体。这些实 验都支持了Wright 的损伤互补原则。