磷脂的提取与分析检测技术王道营 徐幸莲 徐为民(南京农业大学食品科技学院) 【摘 要】磷脂的提取方法主要是萃取法;总含量的测定方法有称重法、比色法、紫外分光光度法等;磷脂不同组分的分离和测定方法有T LC、HPLC和31P-NM R等;利用RP-HPLC和GC可以对磷脂的脂肪酸的组成分析测定;使用HPLC、GC等和M S的联合使用可以对磷脂分子量及分子结构进行分析。
本文分别对上述5个方面进行综述,并对不同方法的特点进行了初步探讨。
【关键词】磷脂;组分;脂肪酸组成;分子结构;分析检测中图分类号:TS224.4 文献标识码:A 文章编号:1009-1807(2005)07-0051-04 磷脂是一类存在于生物界的含磷脂肪物质。
在植物的种子、动物血液和脏器、蛋黄及细菌中与油脂并存,是构成细胞基本结构的必需物质,对维持细胞的通透性和细胞内氧的传递起重要作用。
磷脂可分为3大类:糖基甘油二酯、神经鞘磷脂(SM)和磷酸甘油酯(PL)。
磷酸甘油酯又可分为酯磷脂和醚磷脂,醚磷脂包括胆碱缩醛磷脂和乙醇胺缩醛磷脂,通常所说的磷脂就是指酯磷脂。
酯磷脂主要包括磷脂酰胆碱(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰肌醇(PI)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PG)、磷脂酸(PA)、二磷脂酰甘油(DPG)以及N-乙酰基-磷脂酰乙醇胺(NAPE)等。
一种磷脂就是多种磷脂分子组成的混合物,这造成了磷脂分离和定量上的困难。
本文就磷脂的提取和分析检测技术作一综述。
1 磷脂提取常用的提取方法可归纳为两大类:一是物理萃取法,即用超临界流体技术(SFE-CO2),这是一种新型的分离技术,其操作简单,萃取纯度较高;二是化学萃取法,即用氯仿、甲醇、丙酮、乙醚、乙醇等有机溶剂反复萃取,其操作步骤较复杂。
原料不同,所采用的提取方法也不同。
对于一些粗磷脂产品可以直接取样进行分析;对于大豆油、菜籽油等植物油类样品可采用丙酮沉淀法获取磷脂;对于大豆、动物组织等固体类样品,要先提取样品中的粗脂肪,然后对其进行分离获取磷脂。
如章建浩等人对金华火腿的肌间脂质成分的分析,取股二头肌根据Folc h.J等人方法提取脂质,然后用氨丙基硅柱分离,用2%乙酸-乙醚(W/ W)溶液洗出游离脂肪酸,用甲醇洗出磷脂。
由于磷脂的结构组成比较复杂,采用一种方法可能对某种磷脂的提取效果好但对另一种的提取效果却很差,因此在分析检测之前必须根据分析目的、分析条件等选择合适的提取方法。
2 磷脂总含量的测定方法2.1 称量法称量法有两种:一种是将磷脂混合物用浓硫酸和浓硝酸混合物分解,使磷变成正磷酸根离子,再将后者转化成为磷钼酸铵沉淀称量;另一种方法是利用油脂溶于丙酮,而磷脂不溶于丙酮的性质,用丙酮萃取样品,除去油脂,烘干残留物,称量即得磷脂含量,这种方法主要适用于植物油脂中磷脂总量的测定,其优点是操作简单,但其测定值并非磷脂真实值。
2.2 比色法比色法有钼蓝比色法、硫氰亚铁胺比色法和酶法比色法之分,三者在磷脂检测上均有应用。
钼蓝比色法是将样品与金属氧化物灰化,试样中的磷变为磷酸盐,加酸溶解而得磷酸根,在加入钼酸盐后生成磷钼酸盐,磷钼酸盐被还原而产生钼蓝,其颜色深浅与磷脂含量成正比关系,由此可进行比色定量。
该法容易受样品中无机磷的影响,而使测定值偏高。
高氯酸-浓硫酸-钼锑抗比色法也有报道,它是在钼蓝比色法的基础上发展而来的,由于用强酸消化使分析时间大大缩短,同时用2,6-二硝基酚作酸碱指示剂,从而使显色更加准确。
硫氰亚铁胺比色法原理是:红色硫氰亚铁胺化合物不溶于氯仿,但与磷脂形成的复合物可溶于氯仿,按磷脂和硫氰亚铁胺形成的复合物所产生的颜色于488nm测定吸光度,从而测定出磷脂含量,该法特点是不需要消化,测试时间短。
酶法比色法是利用磷脂酶水解磷脂,然后测定其释放出的产物,在500nm处测定其吸光度值,由于该法测定成本较高,所以应用的并不是很多。
2.3 二阶导数紫外分光光度(UV)法磷脂吸收光谱有两个峰,一个处在240nm左右,一个处在273nm左右,前者吸光度比后者强得多,测定240nm 左右的峰和谷(通常为247nm的峰和239nm谷)之间的垂直距离(D),D与浓度成正比。
其优点是不需经过分离就可直接测定,操作简单、精密度好、回收率高以及相关系数好,但测定值不能完全反映真实值。
2.4 红外光谱(FTIR)法由于C=O、PO2、P-O-C的吸收振动,在磷脂定量分析过程中产生5个谱带:1765～1720nm;1200～1145 nm;1145～970nm;1200～970nm;830～740nm。
可用于测定毛油和脱胶油中含磷量的谱带是1200～970nm谱带,该谱带的振动是由P-O-C和PO2基团产生的。
由于非磷脂成分的C=O基团振动产生的吸收也在1765～1720nm 区域内,所以1765～1720nm谱带不能用于准确测定磷脂含量。
在1200～970nm内产生的振动吸收通过计算机程序进行统计分析,产生线性回归方程以及把磷脂键面积转换为磷脂浓度的皮尔森相关系数,然后计算出磷脂含量。
a i等人还用FTIR分析了大豆中磷脂的组成。
他先用标准磷脂混合样溶解在氯仿中,配成各种浓度的标准溶液,用于确定磷脂的各种化学键振动的波数,并绘制标准曲线,再用标准曲线确定大豆磷脂的含量。
FTIR法与钼蓝比色法相比具有分析速度快、操作简单、可重复性好、效率高等优点。
3 磷脂组分的分离和测定方法3.1 薄层色谱(TLC)法TLC法是将磷脂用硅胶板上行法展层,展开后的板喷布磷脂显色剂。
各种磷脂的定量,可采用薄层色谱扫描仪计算积分值,或将磷脂的斑点刮下来,然后测定磷含量。
TLC法可分为单向和双向两种。
单向TLC能够同时分析几个样品,但很难将组分完全分开;双向T LC可将磷脂各组分完全分开,但是它一次只能分析一个样品。
T LC法通常采用的显色剂有:碘蒸气、Dittme r-le ster钼蓝、Dr agen-dorff试剂、Vaskovsky试剂和茚三酮等。
a i等人用TLC-显影光密度分析法,测定大豆油中磷脂的组成。
他先把2%的水化大豆油离心,再用丙酮去除油脚中的水分和油脂。
干燥后得到的粗磷脂再通过硅胶柱用氯仿洗脱中性油,用甲醇洗脱回收其中的磷脂。
得到的磷脂用氯仿-甲醇-水(75∶25∶3,v/v/v)展开,用钼酸铵和高氯酸显色。
显色的薄板用显影光密度分析仪扫描,分析各组分的含量。
被美国油脂化学协会(AOCS)收录为标准方法的二维TLC-P法是一种更准确的定量分析磷脂的方法。
这种方法是在分离后收集各种磷脂,测定磷含量,再按照各类磷脂的平均相对分子质量计算出它们的含量,还有一些典型的磷脂的双向T LC法见表1。
TLC 法分析过程烦琐,分析时间长,其重复性也较差。
3.2 高效液相色谱(HPLC)法近年来,国外有许多文章报道采用HPLC分析磷脂,因为HPLC能使非挥发性的、热敏感的磷脂在常温得到分离,它的封闭系统减少了磷脂在分析过程中被氧化的可能性,确保实现磷脂的快速、灵敏、准确的定量分析。
HPLC 法一般分为反相高效液相色谱法(R P-HPLC)和正相高效液相色谱法(NP-HPLC),RP-HPLC法的分析时间一般比较短,但分离效果不如NP-HPLC法,一些典型的磷脂的NP-HPLC分析法见表2。
表1 磷脂的双向T LC分析法编号展开剂A v/v展开剂B v/v显色剂定量方法1氯仿∶甲醇∶7mol/L氨水65∶30∶4氯仿∶甲醇∶醋酸∶水170∶25∶25∶6碘蒸气高氯酸、硝酸消化,310nm 比色,标准曲线定量2氯仿∶甲醇∶水65∶25∶4正丁醇∶醋酸∶水60∶20∶20钼酸和硫酸肼喷涂,硫酸甲醇(10%)显色700nm扫描3氯仿∶甲醇∶冰醋酸∶丙酮∶水35∶25∶5∶14∶2正己烷∶乙醚4∶1磷钼酸乙醇(5%～10%,w/v)和Dittmer试剂显色检测波长650nm参比波长400nm下扫描4氯仿∶甲醇∶醋酸∶水80∶14∶14∶3氯仿∶甲醇∶氨水65∶25∶2—在专用的石英棒上展开, FID检测表2 典型的磷脂N P-HPLC分析法编号色谱柱流动相A v/v流动相B v/v检测器分离组分1Hypersilsil ica-5己烷∶异丙醇∶25mM硫酸铵∶乙醇∶乙酸367∶490∶62∶100∶0.6己烷∶异丙醇∶25mM硫酸铵∶乙腈∶乙酸442∶490∶62∶25∶0.6UV206PE,PI,CL,PS,PC,LPS,LQC2ZorbaxR x-SIL己烷∶异丙醇3∶2己烷∶异丙醇∶醋酸铵120∶80∶11ELSDPE,PG,C L,PI,PS,LPE,PC,LPC3Nucleosil100-5己烷∶异丙醇∶甲酸∶氨水79∶20∶0.6∶0.07异丙醇∶水∶甲酸∶氨水88∶10∶0.6∶0.07UV205PE,PS,PI,PC,SM,LPC HPLC法固定相的型号通常有:Hypersil silic a-5、Mi-cropak si-10、Nuc leosil50-5和100-5、Nucle osil100-7和经常用于RP-HPLC法中的C18键合硅胶柱等,选用何种分析柱应根据分析要求而定。
HPLC法最常用的检测器是UV检测器,但由于磷脂种类的繁多,其脂肪酸组成也有很大差异,磷脂必然在UV的吸收较为复杂从而使磷脂的定量不准确。
一些学者试图用其他检测器来得到更好的分析结果。
J.S.Rhee等人用折光指数(RI)检测器替代UV 检测器分析大豆磷脂中的卵磷脂成分。
Mer lin D.Gr ieser等人用梯度洗脱和火焰电离(FI)检测器测定了大豆和玉米磷脂的各组分含量,得到的图谱基线平稳,可以很好地检测PC、PE、PI的含量。
S.Shi-Hua Chen等人用荧光检测器在342nm(激发)和500nm(发射)波长下检测磷脂含量,磷脂先要用Dns-C1进行衍生,得到的衍生物用HPLC分离检测。
冯会迎等人用HPLC-ELSD法测定氢化大豆卵磷脂的含量,结果灵敏度高、操作简便。
ELSD在磷脂分析检测领域内更具有前景。
HPLC法的流动相主要采用常规或梯度淋洗,其所用流动相体系主要有以下两类:一是甲醇-乙腈-H3PO4,但甲醇、乙腈在200～210nm有吸收,这就要求纯度级别很高的试剂,否则基线不稳;二是正己烷-异丙醇-醋酸盐缓冲溶液,但其色谱图基线欠稳, PC峰对称性不好。
HPLC法在磷脂分析中占有非常重要的地位,随着新型检测器的应用,HPLC法分析将更趋于完美。
3.3 31P核磁共振(31P-NM R)法核磁共振(NMR)技术用于磷脂的分析是20世纪90年代才发展成熟的新技术,它利用磷原子的31P的核磁共振效应来分析各种磷脂的组成和含量的,由于不同类型的磷脂化学环境不同,31P的化学位移也不同,由此来确定各种不同磷脂的种类,各种磷脂的含量由核磁响应信号的积分确定。