④ 4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑤取上清至新的EP管中，加300 µl 三氯甲烷， 用手轻轻震荡20s。 ⑥4 ℃， 14000rpm离心8分钟。
⑦取上清至新的EP管中，加250µl异丙醇，混 匀，冰上20分钟。 ⑧4℃，12000rpm离心8分钟。
弃 上 清 ， 加 6 0 0 µl 7 5 % 的 乙 醇 ， 4℃ ， 12000rpm离心8分钟。 室温下干燥（一般干燥5—10分钟）后，加
（1）以所提的突变体和野生型植株的DNA为模板，以F、 R、LBb1为引物两两配对成3对引物对，进行PCR扩 增，20 µl反应体系如下： 10×Buffer 2 µl dNTP 0.4µl 引物 0.4µl 模板 1µl Taq 酶 0.2µl 蒸馏水 16µl （2）PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳及分析。将PCR产物 中加入loading buffer，琼脂糖凝胶电泳，成像。 （3）根据电泳条带的分布与数目，初步判断突变体的 纯杂性
2.PCR鉴定突变体纯合体、杂合体
批注：＋表示有条带，－无条带
结果与分析
• 根据PCR鉴定凝胶电泳的成像图，分析材 料中突变体植株的纯、杂合性。
实验原理
• T-DNA插入到植物染色体上的什么位置以及 怎样插入都是随机的。外源DNA插入到目的 基因后，引起该目的基因的核苷酸组成成 分发生变化。三引物法PCR（F、R、LBb1) 鉴定突变体植株的T-DNA整合的纯、杂合性。
• 材料和试剂
野生型拟南芥、T -DNA插入突变体植株。 液氮、 无水乙醇、 酚氯仿溶液、三氯甲A突变体的鉴定
T-DNA突变体的鉴定 T-DNA突变体的鉴定
• 实验目的 • 实验目的 1、了解植物DNA的提
1、了解植物DNA的提取。 取。 2、掌握T-DNA插入突变体中纯合体、杂合 2、掌握T-DNA插入突 体的鉴定方法。 变体中纯合体、杂合
体的鉴定方法。
实验原理
• Ti质粒是土壤农杆菌的天然质粒,该质粒上 有一段特殊的DNA区段,当农杆菌侵染植物 细胞时,该DNA区段能自发转移进植物细胞, 并插入植物染色体DNA中。Ti质粒上的这一 段能转移的DNA被叫做T-DNA。
内容
1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 2.PCR鉴定突变体纯合性、杂合性
1.突变体与野生型植株的基因组DNA的提取 ①取拟南芥植株一个放于1.5mLEP管中，迅 速放入液氮中1分钟后，研磨至粉末状。
②加入250 µl extraction buffer液，混匀， 在37℃水浴锅中水浴5—10分钟。 ③加入550µl的酚氯仿溶液（加下层），混 匀，轻轻震荡20s,置于冰上1—2分钟。