发光细菌的制备与微生物画制作
实验目的
1.学习制备抗性平板；
2.通过特定质粒转化大肠杆菌，学习细菌转化的基本
原理及方法；
3.验证DNA是遗传物质，加深对中心法则的理解；
4.制作荧光微生物画。
细菌转化原理
▪转化(transformation)是指受体细菌通过直接吸收来自供体细菌或人工重组的含有特定基因的DNA片段，从而获得了相应遗传性状，这种现象称为细菌转化
▪细菌转化的过程是DNA导入和表达的过程。
受体菌的生理状态是影响转化率的首要因素。
▪实验室常用的转化细菌的方法分为化学性感受态菌转化和电打孔转化（又叫电击转化）。
前者需要化学方法处理细菌制备感受态，最为常用；后者虽然受体菌容易制备，也容易获得高转化率，但需要电转化设备。
1928，格里菲斯（Griffith ）肺炎链（双）球菌转化实验，证明遗
传物质可以转化进入细菌，改变细菌特性。
可致病的S 型不致病的R
型
细菌转化发现历史
证实转化物质是DNA.
Avery and co-workers’ proof that the transforming principle is DNA
Hershey 获1969 年诺贝尔奖1952，赫歇（Hershey）和切斯（Chase）
用同位素技术证明，DNA
是遗传分子
35S 标记外壳蛋白质,感染后放射标记不进入大肠杆菌细胞
32P 标记DNA ,感染后放射标记进入大肠杆菌细胞
2008年诺贝尔化学奖—
发现和研究绿色荧光蛋白方面作出杰出贡献
下村修
(Osamu Shimomura)钱永健(Roger Tsien)马丁·查尔菲(Martin Charfie)
绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)
▪GFP是一种在当今生命科学和医学研究中被广泛使用的示踪物。
▪基于GFP的光学成像技术使人们可以直接观察到从微观到宏观各个层次上丰富多彩的生命现象。
GFP的来源---太平洋的神秘荧光生物
其他荧光蛋白
质粒pGEX-4T-EGFP
EGFP：Enhanced GFP即增强绿
色荧光蛋白，是一种优化的突
变型GFP，较普通GFP强35倍。
其蛋白质的最大吸收光谱为
480 nm，因此，比GFP更适合
作为一种报告基因来研究基因
表达、调控、细胞分化及蛋
白质在生物体内定位和转运等。
pGEX-4T-1质粒amp抗性，
GST标签，IPTG诱导基因。
构建好的pGEX-4T-EGFP质粒图谱EGFP基因长度
719bp
质粒pGEX-4T-RFP
一、实验仪器
▪水浴锅
▪台式高速离心机（eppendorf5418）▪移液器一套
▪摇床
▪微波炉
▪超净工作台
二、实验材料
▪载体质粒：
pGEX-4T-1-EGFP（增强绿色荧光蛋白）、
pGEX-4T-1-RFP（红色荧光蛋白）
▪灭菌的EP管、管架、无菌ddH2O
▪转化试剂盒
▪感受态DH5α细胞
▪LB培养基、amp母液100mg/ml、IPTG母液
三、实验步骤
1. amp抗性+诱导LB平板的制备
▪紫外灯照射超净工作台30min；将LB固体培养基用微波炉加热，期间取出摇匀几次，至培养基完全溶化；
▪超净台消毒结束，关闭紫外灯，打开照明灯和风机，抬升超净台前挡板约20cm高度，通风3min；
▪点燃酒精灯，酒精棉球消毒双手和台面，准好无菌培养皿；
▪待培养基不太烫手时，无菌操作加入amp母液，混匀，倒平板，每人2块；一块含amp，一块不含amp。
三、实验步骤
2. 载体质粒转化感受态大肠杆菌（每人一份）
▪每2人一个小冰盒，取DH5α感受态细胞1支（-80℃冰箱）,迅速插入冰中5 min，待菌块刚融化，均分为2管，每管加入质粒3μl, 用手拨打EP 管底轻轻混匀，冰中静置25 min。
▪42℃水浴热激45 s，迅速放回冰上并静置2 min（晃动会降低转化率）。
加入700 μl无抗生素LB 液体培养基，混匀37℃，200 rpm复苏60 min。
▪5000 rpm离心1 min 收集菌体，留200 μl上清轻柔重悬菌块，并涂布到的2种LB 平板（LB+ARB or IPTG、LB+amp+ARB or IPTG）上，每
实验结果：质粒转化DH5a
pGEX-4T-EGFP转化大肠杆菌pGEX-4T-RFP转化大肠杆菌
实验结果：pGEX-4T-1-EGFP转化大肠杆菌
实验结果：pGEX-4T-1-EGFP转化大肠杆菌(蓝光灯下)
油镜下的GFP大肠杆菌
荧光微生物作画
荧光微生物作画
实验报告思考：
1、野生型大肠杆菌可以做转化受体细胞吗，为什么？
2、感受态细胞是什么？制备的原理是什么？
3、细菌转化的原理是什么？
4、对转化实验的结果进行分析，讨论如何提高转化效率？
5、分析实验中质粒的基因表达调节方式，本实验如果使用蓝白斑筛选x-gal平板作为选择平板的话，是否可行？会得到怎样的实验结果？
6、分析荧光细菌的荧光显微观察原理和方法。
微生物艺术画制作：每人一皿，绘制艺术画，对作品有图名和创作灵感说明，作品单独交，同学互评
谢谢。