Caspase与细胞凋亡Caspase与细胞凋亡沈阳市第一人民医院神经内科（110041）李莉摘要：细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death, PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程。

是细胞内由基因编码调控的按严格程序执行的细胞自杀过程。

细胞凋亡是细胞生长发育过程的重要生命现象，是目前生物医学领域中的一个重要研究课题。

阐明细胞凋亡的分子机制可对一些疾病的防治（如肿瘤，神经退行性疾病等）产生积极影响。

许多实验提示细胞凋亡涉及一个瀑布式（Cascade）基因表达过程。

半胱氨酸蛋白酶（Caspase）在细胞凋亡中发挥始动和效应作用。

本文就其生物学特性及其在凋亡中的作用机制作一综述。

关键词：Caspase；细胞凋亡细胞凋亡的原词Apoptosis由两个拉丁字组成。

Apo指离开，ptosis是落下，意思是细胞凋亡有如秋天落叶，到一定时候即失去生命力，遂即脱落，细胞凋亡，又称程序性细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是机体生长发育、细胞分化和病理状态中细胞自主性死亡过程，是细胞内由基因编码调控的，按严格程序执行的细胞自杀过程。

通常需要30到60分钟，细胞凋亡形态学上的变化主要有DNA破碎，染色质凝集，细胞皱缩，线粒体肿胀和凋亡小体形成，而整个过程的结束以凋亡小体被吞噬为标志。

多数类型细胞在凋亡的最后阶段发生细胞核DNA的降解：DNA降解成180-200bp或其倍数的片段，因此在琼脂糖凝胶电泳上可见到有特征性的梯形图谱。

目前对凋亡的研究深入到分子水平，发现多种半胱氨酸蛋白酶（Cysteine aspartase）在细胞凋亡之中发挥着重要作用。

1、什么是Caspase通过对美丽线虫（nematode caenorhabditis elegans）的细胞死亡机制的研究发现，至少有3个基因直接参与了细胞凋亡的调节。

ced-3、ced-4直接介导细胞死亡，为促凋亡基因，其编码的蛋白分别为CED-3、CED-4、ced-3在细胞中起关键作用，称为线虫自杀基因，CED-3则称为死亡蛋白酶；ced-9则拮抗其作用，为抗凋亡基因，其编码的蛋白质为CED-9。

后来发现CED-3与哺乳动物的白介素-1β转换酶（Caspase-1，原名为interleukin-1β-converting enzyme，ICE）具有高度同源性，CED-4，CED-9则分别与Apaf-1（apoptosis protease-activating factor-1）、Bcl-2同源。

Bcl-2基因家族产物包括促进及抑制凋亡的两个蛋白质亚群[1]。

哺乳动物的ICE 类蛋白是一组半胱氨酸蛋白酶[2]；且有以下共同特点：①和ICE有同源性；②有高度保守QACXG（X为R、Q或G）五肽序列[3]；③有发挥酶活性所必须的半胱氨酸；④特异地裂解天门冬氨酸位点；⑤前体蛋白均无活性，均需经蛋白水解后才产生活性；⑥转染不同细胞可诱导凋亡。

因它们均具有半胱氨酸和天门冬氨酸裂解位点，Alnemri将其命名为Caspase，其基因用Casp表示[4]；“C”代表半胱氨酸蛋白酶机制，aspase表示其能特异切割底物中在天冬氨酸（asp）后的肽键能力。

目前在哺乳动物中发现至少16种Caspase，按其发现的先后顺序命名为Caspase-1～Caspase-16[5]。

2、Caspase的生物学特性2.1 Caspase的结构特点Caspase家族有相似的氨基酸序列，结构和底物特异性，通常以无活性的蛋白酶原（procaspase）形式存在细胞内合成和分泌（30-50KD）。

后者由4个亚区组成：NH2-末端区（Prodomain）、大亚基（P17-20）、小亚基（P10-12）及连接大小亚基的连接区；各亚区间经蛋白水解后释放出Prodomain及连接区，使大小亚基结合成一活性的异四聚体并暴露出底物识别，结合和催化所需的氨基酸残基，即形成了活性的Caspase；Procaspase可自我催化及催化其他Procaspase产生活性蛋白酶，其蛋白水解级联功能类似凝血因子活化的“瀑布效应”[6]。

Caspase的作用特点是能识别底物裂解位点NH2末端最少4个氨基酸并在天门冬氨酸后裂解底物，从而使其蛋白裂解行为具有高选择性。

不同的Caspase因所识别的4个氨基酸的不同而具有明显的底物特异性，从而发挥各自不同的生物学功能。

2.2 Caspase家族成员及分类Caspase分类较为复杂，通常根据蛋白酶序列的相似性分为三个亚族：Caspase-1亚族（Caspase-1、4、5、13）；Caspase-2亚族（Caspase-2、9）和Caspase-3亚族（Caspase-3、6、7、8、10）。

在Caspase家族成员中，Caspase-1、2、4、5、8、9、10、11等为调控Caspase，参与打靶和激活调控；Caspase-3、6、7、12、14等为效应Caspase，即参与凋亡的效应物。

Caspase-1（白介素-1β-转换酶，ICE）是该家族中第一个被鉴定的成员，但它在细胞凋亡中并无十分明显的作用，主要参与IL-1β的成熟和转运。

Caspase-8是启动者Caspases的重要代表，可通过与连接分子FADD的结合而活化，将凋亡信号传递到下游的效应Caspases分子。

Caspase-14是该家族中的最新成员，主要表达于胚胎细胞中，成年期缺乏表达，由于分子结构中没有NH2-末端域，因此又被称为MICE（mini-ICE）。

功能研究发现它能直接诱导细胞凋亡，但具体的信号转导途径高不清楚[7]。

并不是所有Caspase都参与细胞凋亡反应，如Caspase-1、4、5、12等的作用主要是参与炎症反应。

Caspase-3是迄今为止研究比较透彻的一个，它是主要的效应者分子。

1994年Femandes-Alnemri等在人Jurkat T细胞系，首先克隆出CPP32（Caspase-3）基因，分为CPP32α和CPP32β。

两者的阅读框均由831个核苷酸组成，编码277个氨基酸，相对分子质量约为32×103（32KD）。

人Caspase-3基因定位于染色体4q33-q35.1处。

Caspase-3酶原与CED-3蛋白有35%的一致性，58%的相似性，是已知哺乳动物中与CED-3相似性最高的一种。

目前推测，Caspase-3酶原上有4个酶切位点Asp9、Asp28（亦称P3切割点）、Asp175（亦称P17切割）和Asp181，后两个位点的切割产生P20（1-175氨基酸）和P11（181-277氨基酸）大小亚基，大亚基进一步在Asp28处切割去掉N末端前肽，而Asp9处的切割产生P19大亚基，其与Caspase-3酶原的自身活化有关。

被切割形成的大亚基、小亚基结合成α2β2四聚体，成为有活性的酶。

在蛋白酶级联切割过程中，Caspase-3处于核心位置，不同的蛋白酶分别切割Caspase-3酶原，从而激活Caspase-3；活化的Caspase-3又进一步切割不同的底物，导致蛋白酶级联切割放大，最终使细胞走向死亡[8]。

因此Caspase-3被称为死亡蛋白酶。

2.3 Caspase的活化Caspase的活化有两条主要途径[6，9]。

一条由DD（death domain）介导，将Caspase-8募集到Fas（即CD95）、TNFR-1、DR3等受体复合物途径。

细胞膜上的Fas、TNFR-1、DR3等死亡受体均含有DD，Caspase-8、10等则含有DED （death-effector domain），而procaspase-1，2，4，5，9含CARD （caspase recruitment domain）。

DD、DED、CARD结构极其相似，可相互作用，在Caspase的活化中起关键的接合作用，称为接合器（adaptor）。

以Fas受体为例，Fas受体激活后，FADD与募集而来的procaspase-8的DED结合形成信号复合物，使procaspe-8自我水解、活化，形成活性Caspase-8，后者再激活Caspase3、6、7等。

另一途径由细胞色素C（cyto-c）介导。

细胞内外各种死亡信号可诱导线粒体释放cyto-C。

cyto-C再与Apaf-1结合，使Apaf-1发生构象改变，继而寡聚化。

然后，Apaf-1的CARD区与Procaspase-9的N-末端的CARD区结合，形成cyto-c-Apaf-1-Procaspase-9“凋亡体”（apoptosome），从而使Procaspase-9活化并激活下游其他Caspase。

2.4 Caspase活化的调节Caspase的活化可引起细胞凋亡。

那么机体是如何抑制Caspase的过度激活百不发生病理性凋亡的呢？已知有三大类蛋白质参与Caspase活化的调节。

2.4.1 FLIP与ARC目前发现有两种蛋白参与Caspase初始活化的调节即FLIP（FADD样的ICE抑制蛋白）和ARC（含有CARD的凋亡抑制蛋白）。

[4、10]从Caspase的激活途径可以看出：调节Procaspase与接合蛋白的相互作用可抑制Caspase的活化。

研究发现FLIP除没有关键的催化残基外，其序列与Procaspase-8相似，可与Procaspase-8竞争FADD的结合位点，达到阻止Caspase活化的目的；ARC可直接与多种Procaspase结合而阻止其活化。

2.4.2 Bcl-2家族Bcl-2家族可调节cyto-c的释放，从而调节cyto-c介导的Caspase的活化[6,11]。

Bcl-2家族成员是一组通道蛋白。

主要位于线粒体、内质网及细胞核的外膜。

BAX通过协助线粒体释放cyto-c而促凋亡；Bcl-2和Bcl-xL则可拮抗Bax的作用而明显抑制凋亡。

另外，Bcl-2家族成员还可能直接与CED-4/Apaf-1结合，抑制cyto-c-Apaf-1-procaspase-9复合物的形成而阻止Caspase-9的激活；而Bax等其他促凋亡的家族成员则拮抗此种作用，增强CED4/Apaf-1的活性。

2.4.3 IAP（inhibitors of apoptosis protein）家族迄今，IAP家族是哺乳动物唯一的内源性Caspase抑制剂。

[12]它包括神经元凋亡抑制蛋白（neuronal apoptosis inhibitory protein,NAIP）、X染色体凋亡抑制剂（X chromosome-linked inhibitor of apoptosis,XIAP）、人凋亡抑制剂（human inhibitor of apoptosis,HIAP）、Survivin等，可特异性地抑制Caspase-3、7、9的活性，使始动Caspase及效应Caspase均受抑制而达到抗凋亡目的。