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一、反转录法
反转录法就是先分离纯化目的基因的 mRNA，再反转录成 cDNA，然后进行 cDNA 的 克隆表达。
cDNA与模板mRNA序列严格互补，而不含内 含子。
cDNA:真核基因经过转录后,经过剪切、拼 接、修饰形成的成熟的mRNA，mRNA反转录的 结果为cDNA。
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第一个合成蛋白质的国家。
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基因工程药物种类
基因工程技术可生产的药物和制剂包括: (1)免疫性蛋白,如各种抗原和单克隆抗体; (2)细胞因子,如各种干扰素,白细胞介素,集
落刺激生长因子,表皮生长因子,凝血因子; (3)激素,如胰岛素,生长激素,心素纳; (4)酶类,如尿激酶,链激酶,葡激酶,组织型纤
50%!
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20世纪70年代基因工程诞生最先应 用在医药科学领域。
1982年第一个基因工程产品--人胰 岛素在美国问世。
优点:大量生产、应用临床、深入研 究、扩大应用。
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结晶牛胰岛素：1965年9月17日，中国首次人 工合成结晶牛胰岛素。这是当时人工合成的具有 生物活力的最大的天然有机化合物，使中国成为
维蛋白溶酶原激活剂,超氧化物歧化酶.
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基因工程药物：采用基因工程技术研制的， 能预防和治疗某种疾病但含量极微而难以 用传统方法制取的特殊药物。
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第二节 基因工程药物生产的基本过程
基因工程技术是将重组对象的目的 基因插入载体，拼接后转入新的宿主细 胞，构建成工程菌(或细胞），实现遗 传物质的重新组合，并使目的基因在工 程菌内进行复制和表达的技术。
除菌过滤
半成品检定
成品检定
包装
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基因工程药物生产的上游和下游
上游：主要指的是目的基因分离、工程菌 （或细胞）构建。上游阶段的工作主要在 实验室内完成； 下游：主要指的是从工程菌（或细胞）的大 规模培养一直到产品的分离纯化、质量控 制等。
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17ห้องสมุดไป่ตู้
工程菌（或细胞）构建中重要的工具
该过程中重要的工具便是酶：限制性内切 酶和连接酶是将所需目的基因插入适当的载体 质粒或噬菌体中并转入大肠杆菌或其他宿主菌 （细胞）大量复制目的基因过程中的重要工具。
第二章 基因工程制药
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主要内容： ➢ 基因工程制药的基本过程。 ➢ 目的基因的获得及基因的表达。 ➢ 基因工程菌的生长代谢特点，其质粒不稳定
产生的原因及提高质粒稳定性的方法。 ➢ 基因工程菌的培养方式，发酵工艺及培养设
备。 ➢ 基因工程药物的分离纯化。 ➢ 基因工程药物的质量控制。
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工程菌（或细胞）构建中重要的工具酶
➢ 大肠杆菌DNA聚合酶I：5’—3’DNA聚合酶活 性。
➢ 逆转录酶：转录RNA为DNA的酶。
➢ 核酸酶S1：能降解单链DNA和RNA ，打开cDNA 双链的发卡结构。
➢ T4DNA连接酶：连接3’ 羟基 5’磷酸游离端。
➢ 末端脱氧核苷酰转移酶：催化一个单核苷酸转 移到一个DNA分子的3’羟基末端。
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⒊cDNA第二链的合成
除去杂交链中的mRNA链，然后以cDNA第 一链为模板合成第二链。
⒋cDNA的克隆 将cDNA与载体连接（质粒DNA,噬菌体
DNA ）
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人工接头:人工合成的，连接在目的基因两端的含有 某些限制性酶切为点的寡核苷酸片断。
⒌将重组体导入宿主细胞 噬菌体感染大肠杆菌，质粒转化大肠杆菌。
有DNA在体外反转录成cDNA，与适当的载体 常用噬菌体或质粒载体连接后转化受体菌， 则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增， 这样包含着细胞全部mRNA信息的c目的基 因要进行限制性内切酶和核苷酸序列分析。
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第三节 目的基因的获得
难点： ➢ 真核生物的单拷贝基因在整个基因中很小
部分； ➢ DNA很大，组建物理图谱和基因定位很难； ➢ 真核生物基因含内含子是断裂基因，它在
原核生物中不表达。
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克隆真核基因常用方法：反转录法， 反转录-聚合酶链反应法，化学合成法， 筛选基因和对已经发现的基因进行改造。
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基因工程基本过程
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基因工程药物制药的主要程序: ⒈目的基因的克隆， ⒉构建DAN重组体， ⒊构建工程菌， ⒋目的基因的表达， ⒌表达产物的分离纯化， ⒍产品的检验等。
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基因工程药物制药的主要程序
获得目的基因 组建重组质粒 构建工程菌（或细胞）
培养工程菌
产物分离纯化
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第一节 概 述
传统生物药物由于来源及制备上的困难、 价格等因素的影响，此外在制备过程可能 受到的病毒、衣原体、支原体等的感染等 问题，促使人们寻求安全、实用、疗效可 靠的新方法来制备生物药物。
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人体来源：人血浆中制备人血浆白蛋白； 男性尿中制备尿激酶；孕妇尿中制备绒膜促性 激素；人血白细胞中制备白细胞介素等。
动物来源：猪胰脏中制备胰岛素；新鲜猪 血中制备SOD；健康猪、牛肝制备核糖核酸 等。
植物来源：新鲜茶叶制备SOD；麸皮中制 备植物钙镁与肌醇；玉米胚芽油中制备植物不 饱和脂肪酸等。
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玉米胚芽
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麸皮
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生物技术的核心就是基因工程，基因 工程技术最成功的应用就是用于生物治 疗的新型生物药物的研制。
cDNA克隆示意图
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⒈mRNA的纯化 mRNA的特点:3‘末端含有一多聚腺苷酸组成的
末端。方法:亲和层析法
➢ 选材：mRNA丰富，目的基因表达活跃
➢ 注意点：防止RNA酶污染 ⒉cDNA第一链的合成 一般 mRNA都带有3‘-polyA,所以可以用寡聚
dT作为引物,在逆转录酶的催化下,开始cDNA链的 合成。用放射性探针法检测。
基因工程正在逐渐显示其在生物技术药 物制备上的优势。
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胰岛素是治疗糖尿病的特效药， 长期以来只能依靠从猪、牛等动物的 胰腺中提取，100Kg胰腺只能提取4-5g 的胰岛素，其产量之低和价格之高可 想而知。
将合成的胰岛素基因导 入大肠杆菌，每2000L培养液 就能产生100g胰岛素！大规 模工业化生产不但解决了这 种比黄金还贵的药品产量问 题，还使其价格降低了30%-