RNA（核糖核酸）
存在于细胞质中，如mRNA, rRNA, tRNA等。
除上述DNA，RNA外，还有非细胞形式存在的病毒和噬 菌 体，其或只含DNA，或只含有RNA。
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二、DNA提取的几种方法
(一） 非基因组DNA的提取 ➢ 质粒DNA的提取
• 碱裂解法 • 煮沸法 ➢ 线粒体、叶绿体DNA的提取 • 差速离心结合SDS裂解法
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质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当用碱处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在回到中性pH时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
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（二）基因组DNA的提取－ SDS法 SDS法流程图 （以动物组织为例）
动物组织
抽提
离心洗涤
组织匀浆
上层溶液
干燥溶解
细胞裂解
酒精沉淀
DNA溶液
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（三）基因组DNA－其它方法 根据细胞裂解方式的不同有：
➢ 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、冻融法
➢ 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法 ➢ 生物方式：酶法
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质粒DNA－碱裂解法
碱裂解法流程图
对数期菌体
上清液
沉淀
溶液I充分重悬
抽提
干燥溶解
溶液II裂解 溶液III中和
酒精沉淀 离心洗涤
质粒DNA溶液
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质粒DNA－煮沸法
煮沸法原理
➢ 染色体DNA比质粒DNA分子大得多，且染色体DNA为线状分 子，而质粒DNA为共价闭合环状分子；
➢ 当加热处理DNA溶液时，线状染色体DNA容易发生变性，共 价闭环的质粒DNA在冷却时即恢复其天然构象；
➢ 变性染色体DNA片段与变性蛋白质和细胞碎片结合形成沉 淀，而复性的超螺旋质粒DNA分子则以溶解状态存在液相 中，从而可通过离心将两者分开。
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细胞器DNA－差速离心法
线粒体和叶绿体是生物体内半自主性细胞器，自身可编码蛋 白，它们的比重和大小一定，因而在同一离心场内的沉降速度 也一定，根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各 种组分分级分离出来。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的经典配方
核酸的提取及鉴定
核酸是遗传信息的载体，是最重要的生物 信息分子，是分子生物学研究的主要对象， 因此核酸的提取是分子生物学实验技术中最 重要、最基本的操作 。
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一、核酸的分类
DNA (脱氧核糖核酸)
主要存在于细胞核的染色体中。 核外也有少量DNA，如线粒体DNA（mtDNA），叶绿体DNA
（cpDNA），质粒DNA。
组份 终浓度
Tris-HCl （pH8.0）
EDTA （pH8.0）
NaCl
CTAB
β-巯基乙醇
100 mM
20 mM
1.4M
2%(W/ V)
0.1% （V/V）使 用前加入
➢ Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏； ➢ EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性； ➢ NaCl 提供一个高盐环境，使DNP充分溶解，存在于液相中； ➢ CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离； ➢ β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除
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（三）基因组DNA－其它方法
➢ 浓盐法：
利用RNP和DNP在盐溶液中溶解度不同，将二者分离
➢ 有机溶剂抽提法：
有机溶剂作为蛋白变性剂，同时抑制核酸酶的降解作用
➢ 密度梯度离心法：
利用不同内容物密度不同的原理分离各种内容物
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（四）动物基因组DNA的提取
主要方法： (1)浓盐法 利用RNP和DNP在电解溶液中溶解度不同，将二者分离。 1）用1M 氯化钠提取,得到的DNP粘液 2) 与含有少量异戊醇的氯仿一起摇荡,使乳化 3) 离心除去蛋白质,此时蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相 中间，而DNA位于上层水相中 4) 用2倍体积95%乙醇可将DNA 钠盐沉淀出来.
的络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能 和多糖结合，有效去除多糖。
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（二）基因组DNA提取－ CTAB法
CTAB法流程图
植物材料
裂解液
酒精沉淀
液氮研磨
抽提
离心洗涤
DNA溶液
细胞裂解
上层溶液
干燥溶解
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（二）基因组DNA的提取－ SDS法
SDS法原理
➢ SDS是一种阴离子去垢剂，在高温（55～65℃）条件下能裂解细 胞，染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；
差速离心法原理
➢ 是利用物质比重的不同分离混合物的一种方法。 将待分离物质置于均匀介质（蔗糖）中，以一定的转速 进行离心，比重大的物质优先沉降，比重小的却处于上层， 从而得以分离。
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（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB法原理
➢ CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。
➢ 提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度（冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；
➢ 上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
组份
Tris-
HCl （pH8. 0）
EDTA （pH 8.0 ）
NaCl
SDS
终浓 10
度
mM
20 mM 0.4M 2%
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（三）基因组DNA－其它方法
根据核酸分离纯化方式的不同有：
➢ 吸附材料结合法：
• 硅质材料
高盐低pH值结合核酸，低盐高pH值洗脱。 快捷高效。
• 阴离子交换树脂 低盐高pH值结合核酸，高盐低pH值洗脱。
适用于纯度要求高的实验。
• 磁珠
磁性微粒挂上不同基团可吸附不同的目的 物，从而达到分离目的。
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（二）基因组DNA的提取－ CTAB法 CTAB提取缓冲液的改进配方
组份
终浓 度
Tris-
EDTA
HCl
（pH8.
（pH8.0）0）
100
20
mM
mM
NaC l
1.4 M
CTAB
3%(W /V)
PVP40
5%(W /V)
β-巯基乙 醇
2%（V/V） 使用前加 入
❖ PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶