第17卷第4期化 学 研 究V o.l 17 N o .42006年12月CHE M I CAL RESEARC H D ec .2006金线莲总生物碱的提取及含量测定钟添华1,黄丽英1,王 勇2(1.福建医科大学药学院,福建福州350004; 2.福建省药物检验所,福建福州350004)收稿日期:2006-08-02.作者简介:钟添华(1980-),男,硕士,主要从事天然药物有效成分的提取及结构鉴定工作,E O m ai:l zt h23-1980@163.co m.摘 要:建立了金线莲总生物碱的提取和测定方法.将金线莲全草粉末用p H =2的水溶液提取,以阳离子交换树脂吸附后,经酸化,用氯仿/甲醇(体积比2B 1)对其进行索氏提取,蒸发有机溶剂.冷冻干燥即得金线莲总生物碱.以盐酸麻黄碱为对照品,酸性染料比色法测定总生物碱,折算为盐酸麻黄碱获得总生物碱含量.测得金线莲总生物碱含量是0.0794%,线性回归方程A =0.0092C -0.0016(r =0.9999),回收率103.13%.本提取及含量测定方法操作简单,总生物碱的提取率较高.关键词:金线莲;总生物碱;提取分离;酸性染料;比色法中图分类号:R 284.2文献标识码:A 文章编号:1008-1011(2006)04-0068-03Extraction and Deter m i nation of t he A l kaloi ds i nAnoectochil us For mosanusZ HONG T i a n-hua 1,HUANG L-i y i n g 1,WANG Y ong 2(1.P har m ac y C oll ege of Fujian M e d ic a l Un i versit y,Fuzh ou 350004,Fujian,Ch i na;2.F ujian Insitit u te for D rug Control ,Fuzhou 350004,Fujian,Ch i na )Abstract :Developed a m ethod to extract and deter m ine the to tal alkaloids fro m anoectoch ilus for m osa -nus .H erbs of anoectochilus for m osanus w ere leached by aci d ifi e d w ater ,and the total alka l o ids i n t h eleached so l u ti o n w ere absorbed by cation i c exchange resi n ,then t h e resi n w as acidified and extractedw ith a m i x ed organ ic so lvent i n a Soxh let extractor .The tota l a l k alo i d s w ere tested at 412n m w ith t h espectroscopy by acid dye .The cali b rati o n cur ves of alka l o ids w ere li n ear(r =0.9999).The recoveryw as perfect(103.13%).M ostly ,the content o f the to tal alka loids i n the herb is 0.0794%.Them et h od for ex traction and de ter m inati o n is si m ple ,qu ick w it h h i g h recovery .Keywords :anoectochilus for m osanus ;to ta l a l k alo i d s ;extracti o n ;acid dye ;co l o ri m etric m ethod金线莲系兰科(Orchi d aceae)开唇兰属(Anoectochil u s )多年生草本植物,该属植物已发现35种,在我国约有20种[1].本属的部分种全草民间作药用,其中具有神奇功效、享有/药王0、/金草0、/乌人参0的珍稀草药金线莲备受人们的关注[2],特别在福建和台湾民间,广泛用于治疗肝炎、肾炎、肺炎、小儿惊风高热、糖尿病、高血压、肿瘤、风湿病等[3],还兼治小儿发育不良及毒蛇咬伤[4].据报道,金线莲中含有糖苷类化合物、有机酸、甾体化合物、黄酮类化合物、糖类化合物、生物碱[5-10]等.作者主要研究了金线莲中总生物碱的提取及测定.1 实验部分1.1 仪器与试剂DJ -10A 型倾倒式粉碎机(上海淀久中药机械制造有限公司),UV-752PC 型紫外分光光度计(上海光谱第4期钟添华等:金线莲总生物碱的提取及含量测定69仪器有限公司),KQ-250D型医用数控超声清洗器,RE-52AA型旋转蒸发仪,FD-1冷冻干燥机(北京博医康技术公司).盐酸麻黄碱对照品(中国药品生物制品检定所,批号:714-9903,供含量测定);0.1%溴麝香草酚蓝乙醇溶液;柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液(pH5.4);聚苯乙烯磺酸氢型离子交换树脂(型号:001@7型,北京化工厂);金线莲干燥全草(购自福建省同春药业有限公司,产地广西.经福建省药检所中药室游勇基主任药师鉴定).以上试剂除专门提到外,均为分析醇,实验用水为二次蒸馏水.1.2实验方法1.2.1树脂的预处理将新的树脂加适量的丙酮在索氏提取器中抽提2h,除去有机物,将树脂取出晾干,蒸馏水湿法装柱.柱子先用3%盐酸淋洗,除去Fe3+,铁氰化钾检查不变色后,用3%氢氧化钠淋洗,使树脂转化为钠型,蒸馏水冲洗到弱碱性,用稀盐酸冲洗到p H约为3,使之转化为H型,最后用蒸馏水冲洗到中性,且Ag NO3检验无AgC l为止,准备上样.1.2.2金线莲总生物碱的提取将金线莲全草粉末300g(过80目筛)放入下口瓶中;用pH2的盐酸浸泡72h,并加入少许氯仿防止溶液发霉变质;再将下口瓶超声1h,取出,于离心机中离心30m in,转速3500r#m i n-1,抽滤,收集滤液备用.将滤液流经处理好的阳离子交换树脂,调节流速使生物碱完全吸附到树脂上,尔后流速控制在约0.5mL# m in-1.可以观察到当含有生物碱的滤液通过层析柱时,一条棕黑色的色带自上而下缓缓向下移动.取上述滤渣再浸提72h,进行下一次渗漉,操作同上,用碘化铋钾检测直至渗漉液中检测不出生物碱为止.当层析柱中大部分树脂吸附了生物碱后,用水洗树脂至中性,将柱中吸附有生物碱的树脂全部倒出,在70-80e的水浴中烘烤随时观察,避免树脂烤焦,烘干后的树脂拌入2m o l#L-1的盐酸适量,搅拌均匀.放置4h后将树脂用滤纸包好放入索氏提取器中,先用氯仿/甲醇(2B1)浸泡过夜,然后进行回流提取12h.当提取液接近无色时,可适量滴加几滴浓盐酸,再回流提取,如此重复5次,当提取液中检测不出生物碱时,旋转蒸发溶剂冷冻干燥得粗总生物碱3.3234g.1.2.3生物碱检定取2mL浓缩液置于离心管中,同时取一等重蒸馏水作空白放入离心机中离心5m in,转速9000r# m in-1,取上层清液,均加碘化铋钾试剂同上离心5m i n,发现样品管中有棕黑色沉淀生成,而空白管没有沉淀.可证实提取物为生物碱成分.1.2.4标准曲线精密称取盐酸麻黄碱对照品0.0134g,置于100m L容量瓶中,加水定容至刻度,得含盐酸麻黄碱浓度为134m g#L-1的对照品溶液.精密量取盐酸麻黄碱对照品标准溶液1,2,3,4,5mL置于干燥的分液漏斗中,分别补水至5m L,再精确加入5mL p H5.4柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液,1mL0.1%溴麝香草酚蓝溶液,氯仿10mL,振摇混匀待用.精确量取1mL于10mL容量瓶中用氯仿定容至刻度,摇匀.另取5mL二次纯化水,同法操作,作为空白对照液,在412nm进行测定,以取样量为横坐标,吸收值为纵坐标,得回归方程A= 0.0092C-0.0016,r=0.9999(n=5).结果表明,盐酸麻黄碱在16-80L g#m L-1范围内线性良好. 2结果与讨论2.1金线莲总生物碱的含量测定[10]取金线莲总生物碱0.0276g用氯仿溶解并定容到100mL备用.精确移取适量的待测液于分液漏斗中,实验方法同1.2.4测其吸光值,5次测定平均值为0.0794%,RSD为0.12%.2.2加样回收实验精密称取金线莲总生物碱16.5m g,准确加入浓度为134m g#L-1的盐酸麻黄碱对照品溶液4mL.按照1.2.4项制备供试液和空白对照液,在最大吸收波长处测定样品,其结果见表1,平均回收率为103.13%, RSD为0.2687%.2.3讨论生物碱作为中草药有效成分之一是近年来研究的热点.传统的生物碱提取分离方法有溶剂法,离子交70化学研究2006年换树脂法等.我们平行比较了0.1%盐酸传统的溶剂提取方法以及本文采用的阳离子交换树脂法.提取率分别为:0.1%盐酸为0.00148%,阳离子交换树脂法为0.0794%.结果表明,阳离子交换树脂上吸附生物碱用混合溶剂索氏提取生物碱稳定,且提取效率高,操作简单,溶剂用量少,证明是一种高效的总生物碱提取方法.表1加样回收实验一览表T able1T he results of t he recovery test(n=5)编号样品中总生物碱量/m g加入标品盐酸麻黄碱量/mg测得量/mg回收率/%RSD/%116.60.53617.1103.01216.70.53617.2102.99316.50.53617.0103.030.2687416.60.53617.1103.01516.60.53617.2103.61金线莲与盐酸麻黄碱紫外扫描图谱在412n m处均有较大吸收,且TLC法样品在412nm处展距与标准品相符.由于总生物碱中各种生物碱紫外吸收具有加和性,故本法采用将经阳离子交换树脂吸附,索氏提取后的金线莲粗总生物碱含量折算为盐酸麻黄碱的含量,对金线莲总生物碱含量进行测定.总生物碱的含量测定方法众多,如紫外分光光度法、紫外薄层层析法、重量法、滴定法和酸性染料比色法等.本文采用酸性染料比色法.该法灵敏度高,准确性好,操作简便,克服了重量法和滴定法均需多次萃取易造成误差而导致重现性差的不足.台湾学者陈春雄等[8]从本属不同种的台湾金线莲中提取出生物碱,其主要成分是异亮石松碱(isoselag-i n e),动物实验结果表明,其有强烈的镇痛作用.通过对金线莲总生物碱的提取及含量测定,进一步了解其活性,可为日后对其进行结构改造以获得有效的镇痛剂提供依据.参考文献:[1]中国科学院中国植物志编委.中国植物志(第17卷)[M].北京:科学出版社,2000.204.[2]唐明仪,王建勤.对5中药大辞典6载虎头蕉物种的探讨[J].海峡药学,1995,7(2):76-79.[3]Shyur L 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