链霉亲和素
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
1、亲和素-生物素-过氧化物酶技术(ABC法)
（1）原理：ABC法是利用亲和素分别连接生物素 标记的第2抗体和生物素标记的酶。生物素标记的第 2抗体与ABC复合物相连接，最后加底物进行显色反 应。其中，ABC复合物是将过氧化酶结合在生物素 上，再将生物素-过氧化酶连接物与过量的亲和素蛋 白反应而制备的。
包括BAB-ELISA，BA-ELISA和ABC-ELISA等技 术。
第2节 免疫胶体金检测技术
一、概
述
免疫胶体金标记技术是以胶体金颗粒为示踪标记物 或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记 技术。已广泛应用于光镜、电镜、流式细胞仪、免疫 转印、体外诊断试剂的制造等领域。 胶体金即水溶胶，是一种带负电荷的疏水胶体溶液， 具有一般溶胶的特性，主要通过还原剂将氯化金分子 聚合成特定大小金颗粒的方法而产生。可通过采用柠 檬酸、抗坏血酸钠和白磷等还原氯金酸或四氯化金而 制备胶体金。胶体金颗粒可通过静电吸引及其表面的 物理特性与多种生物分子(如抗体、SPA)相结合，形 成蛋白质-金颗粒复合物，即胶体金标记物(胶体金探 针) 。
二、原理
胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏 血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下，可聚合成一定大小 的金颗粒，并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态， 形成带负电的疏水胶溶液，由于静电作用而成为稳定 的胶体状态，故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负 电荷，可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合， 由于这种结合是静电结合，所以不影响蛋白质的生物 特性。
二、原理
免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主 要利用了金颗粒具有高电子密度的特性，在金标蛋白 结合处，在显微镜下可见黑褐色颗粒，当这些标记物 在相应的配体处大量聚集时，肉眼可见红色或粉红色 斑点，因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中， 这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大，称之为免 疫金银染色。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
3、标记生物素-亲和素技术(AB)
LAB法是以生物素标记抗体作第1抗体，酶标记亲
和素作为第2抗体。
BRAB法和LAB法都需以生物素标记第1抗体，应
用不如ABC法普遍。但是，用于免疫细胞中免疫球
蛋白的显示具有特异性。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
4、生物素-亲和素或链霉亲和素ELISA检测技术
1、生物素 生物素(biotin)是一种广泛分布于动、植物 组织的生长因子，亦称辅酶R或维生素H，尤以蛋黄、 肝、肾组织中含量较高。结构式中的咪唑酮环是与亲 和素结合的主要部位。利用生物素的羧基加以化学修 饰后，可以制成各种活性基团的衍生物，称为活化生 物素。针对不同的被标记物可以应用不同类型的活化 生物素。
目前最灵敏的免疫组化二抗检测系统 由于亲和素和生物素有极强的亲和力（其亲和力
比抗体和大多数抗原的亲和力高100万倍），因而亲
和素和生物之间的结合是不可逆的。此外，亲和素
具有4个生物素结合位点，大多数蛋白质包括酶可以
和多个生物素分子结合。利用这些特征，可以把亲
和素和生物素化的酶结合为大分子复合物（ABC’s）。
一、生物素与亲和素的特性
2、亲和素 (avidin)：是一种存在于鸡蛋清中的碱性糖 蛋白，结晶呈白色粉末状，易溶于水。在pH 2～13 缓冲液中性质稳定，消化道多种蛋白水解酶不能使其 失活。它对热的耐受性较强，经80℃温度作用2min 仍保持活性。亲和素是由4个相同的亚单位组成的四 聚体，富含色氨酸，通过色氨酸与生物素的咪唑环呈 十分牢固的结合。亲和素的每个亚单位可结合1个分 子生物素，因此1个亲和素分子可结合4个生物素分 子。
第2节影响
章节安排
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
的因素 第二节 免疫胶体金检测新技术
第三节 免疫电镜技术 第四节 免疫转印技术
[目的与要求]
1、了解标生物素-亲和素免疫检测技术的原理及 种类。 2、理解免疫胶体金检测技术的原理及常用的检 测方法。
3、了解免疫电镜技术的应用。
4、了解免疫转印技术的原理及应用。
[难点与重点]
重点：免疫胶体金检测技术的原理。 难点：免疫胶体金检测技术的原理。
第一节 生物素-亲和素免疫检测新技术
利用生物素与亲和素专一性结合以及生物素、
亲和素既可标记抗原或抗体，又可被标记物所
标记的特性，可建立生物素-亲和素系统来显示
抗原抗体特异性反应的各种免疫检测技术。
一、生物素与亲和素的特性
使用步骤：1．加入一抗，与切片孵育。如加入兔抗 肿瘤相关抗原的抗体。2．加入生物素化二抗，如生物 素化抗-兔IgG。3．加入亲和素-生物素化酶复合物 （ABC）。4．加入酶作用底物，定位抗原。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
2、桥亲和素-生物素技术(BRAB)
原理及应用：方法是用生物素分别标记抗体和酶， 然后以亲和素为桥，把两者连接起来。检查抗原时， 先用生物素标记的抗体与细胞(或组织内)的抗原反应， 洗去未结合的抗体，加人亲和素孵育后，洗去未结合 的亲和素，再加入已标记酶的生物素孵育，洗片，以 细胞化学方法呈色反应。
二、原理
胶体金除了与蛋白质结合以外，还可以与许多其它 生物大分子结合，如SPA、PHA、ConA等。根据胶体 金的一些物理性状，如高电子密度、颗粒大小、形状 及颜色反应，加上结合物的免疫和生物学特性，因而 使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细 胞生物学等领域。
二、原理
胶体金标记，实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶 体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗 粒表面负电荷，与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而 形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各 种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球 形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能，可以与葡萄球 菌Ａ蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、 激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合，因而 在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。
二、亲和素-生物素系统免疫检测技术类型
1、亲和素-生物素—过氧化物酶技术(ABC法) （2）应用： ①组织切片和细胞悬液中抗原的检测 ②在免疫电镜中的应用 标记抗体渗透性是免疫 电镜技术的关键，小分子的生物素就可得到更高的 渗透力，且生物素化抗体可在组织包埋前或包埋后 加入，因此ABC法进行抗原的亚细胞水平定位分析 得到较好的应用。