石蜡切片技术
为什么选择这一技术呢？主要因为它有 以下优点：便于推广、经济、适用、简
容易； 设备要求不高 ； 可长期保存； 染色容易，而且都能被染色，形成好的反
差和好的选择性。
石蜡切片技术
杀生（取材）——固定——冲洗——脱水— —保存——透明——石蜡透入——包埋—— 切片——复水——染色——脱水——封藏— —观察保存 （一）取材、固定、洗涤、脱水 （二）透明、透蜡、包埋 （三）切片、贴片 （四）染色、封藏
石蜡切片技术
石蜡切片技术
光学显微镜发展到一定程度之后，渴望知道细胞 结构
由于组织太厚，光线很难穿过 压片可使组织变薄，但引起变形、易位，除核外，
看不到其他结构，因此需要切片变薄。 因细胞水多，太软，无法切片
鉴于上述情况找到一种方法使细胞水被替代， 变硬，能直接切片的方法，最广泛使用的就是 石蜡切片技术
石蜡切片技术
(1) 冲洗彻底——否则收缩、变硬、抽取 (2)不能时间太长太急——变软，肿胀（吸水） (3) 摇动有利于冲洗干净——加快分子运动
石蜡切片技术
1. 目的： 因石蜡与水不混合，在用石蜡透入前必须将细 胞中的水彻底脱掉，否则石蜡进不去材料，无 法让细胞变硬，无法进行切片。
石蜡切片技术
脱水剂的选择 原则：①凡与水和石蜡亲和性好的②且不使细胞剧烈收 缩膨胀，③不能大量抽提细胞成分均可作为脱水剂。常 用的是乙醇和丙酮，使用乙醇最多，此外还有叔丁醇、 正丁醇等。
石蜡切片技术
1.目的： 为了使取样的细胞在形态结构和成分方面保
持与生活的状态一样，就必须迅速杀死细胞避 免失水变形，自溶破坏结构等。 固定液的选择：快；不溶解；不收缩膨胀； 软硬适中；增加折光度；增加染色能力；长期 保存等7项。
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（1）固定剂的种类：一般采用化学固定 单纯固定：只用一种试剂固定： 混合固定：用两种或两种以上的试剂混合在
石蜡切片技术
杀生（动物） 1.目的：动物必须杀生，然后取出所需组织 2.方法：一般采用乙醚（氯仿）麻醉后解剖，取
出所需组织。 3.注意事项：
性别合适 麻醉前动物生活正常，以免影响其代谢活动，
进而影响细胞结构 取材部位要准， 速度快
石蜡切片技术
1.目的：得到所需要的组织 2.方法：a.用剪刀剪下组织
石蜡切片技术
卡诺氏固定液(Carnoy's Fluid) 适用于一般植物 组织和细胞的固定,常用于根尖,花药压片及子房石 蜡切片等.有极快的渗透力,根尖材料固定15— 20min即可,花药则需1h左右,此液固定最多不超 过24h,固定后用95%酒精冲洗至不含冰醋酸为止; 如果材料不马上用,需转入70%酒精中保存.固定 液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维 持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的 嗜碱性，达到优良染色效果。
石蜡切片技术
F.A.A固定液 又称标准固定液,万能固定液.适 用于一般根,茎,叶,花药,子房组织切片.在植物 形态解剖研究上应用极广;
FAA固定液的优点在于：兼有保存剂作用,冰 醋酸既能抵消酒精和甲醛对组织的收缩作用又 是细胞核的优良固定剂，沉淀核蛋白，且对免 疫组化无碍更无掉片之理。FAA固定液具有强 大的固定效能，较之单纯固定更科学更快更好！ 对染色体的观察效果较差.
b.冲洗动物组织，动物（生理盐水、糜蛋白酶溶液） 植物（缓冲液或水）冲洗干净，防止失水，避免压挤损伤， 用生理盐水、糜蛋白酶冲去表面的血、粘液和赃物。
c.切成小块 3注意事项：
▪ 要准 ▪ 要快 ▪ 避免损伤（方向，刀要快，不能挤压） 植物取材：用剪刀剪下材料时一定要植物生活正常，不要 因缺水、营养和温度光照发生明显改变，影响细胞结构， 同时发育程度、部位要准。
石蜡切片技术
静置固定：将组织块放入盛有固定液的小的 称量瓶、小烧杯或青霉素瓶中，在室温或低 温（0~4℃）固定一段时间，不断摇动能增 加固定效果，植物和动物经常使用这种方法。
灌注固定：常用于动物，将固定液通过已麻 醉的动物血管中，让血液流动，固定所需细 胞，该方法有点，固定均匀，不出现自溶现 象，但较繁琐。
石蜡切片技术
静置冲洗：加入冲洗液，静置一段时间，倒出 该液，加入新的冲洗液，反复几次（5~6次）， 每次30分钟左右，振荡有好处。（时间开始 一次为20~30分钟，以后几次可延长1~2h，） 具体时间与材料性质、大小和温度有关。
流水冲洗：将小瓶用纱布蒙住，放入盆中，流 水冲洗，效果较静置冲洗为好，时间为 12~24h，但流水不能太大太急，也不能太长， 太长使组织变软肿胀，冲洗时间有时长达24h 左右，如木本植物的木质部。
一起进行固定如：
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福尔马林formalin:10%的甲醛（37%—— 40%）
醋酸（0.3%~5%） 苦味酸（饱和溶液，三硝基苯酚） 铬酸0.5~1% 锇酸1~2% 升汞（氯化汞饱和水溶液约7%）
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用两种或两种以上的试剂混合在一起进行固定如： 卡诺氏固定液
酒精：冰醋酸（3：1） 酒精：冰醋酸：氯仿（6：1：3）适用于动植物一般 组织细胞。 FAA 福尔马林(38%甲醛)5 ml: 冰醋酸5ml:70%酒精90 ml 幼嫩材料用50%酒精代替70%酒精,可防止材料收 缩;还可加入5 ml甘油(丙三醇)以防蒸发和材料变硬. 但单细胞及丝状藻类除外，也不适于细胞学研究
石蜡切片技术
固定条件的选择：种类、浓度、温度和时间 固定要快否则会自溶： 组织快，不能太多，否则固定不透：
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1.冲洗的目的 除去固定剂，主要是防止固定的毒害作用，
固定时间太长，组织收缩变脆。
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⑴ 冲洗液随固定液而定，冲洗的选择：不形变 提取，不反应，有效除去固定液。 ①固定液为水溶液时，以水或低浓度的酒精冲 洗； ② 固定液是酒精多以不同浓度的酒精冲洗， 以酒精冲洗，浓度要低于固定液的酒精浓度。 材料与酒精的比例一般为1：10（加入的体积） （70%乙醇换洗3次，每次20~60min ）