［文章编号］ １６７１－５８７Ⅹ（２０１２）０３－０５９０－０５［收稿日期］ ２０１１－０８－１５［基金项目］ 国家自然科学基金资助课题（３０９１０１０３９０３，３０７７０１２０）［作者简介］ 王 爽（１９７６－），女，吉林省长春市人，主治医师，医学博士，主要从事真菌分子学鉴定及耐药机制的研究。
［通信作者］ 王 丽（Ｔｅｌ：０４３１－８５６１９４８６，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｌｉ９９＠ｊｌｕ．ｅｄｕ．ｃｎ）真菌胞内蛋白质提取方法的建立王 爽１，２，姜兰香１，张 宇２，３，贺 丹２，田 庄２，高 嵩２，横山耕治４，王 丽２（１．吉林大学第二医院皮肤科，吉林长春１３００４１；２．吉林大学白求恩医学院病原生物学系，吉林长春１３００２１；３．吉林大学第二医院检验科，吉林长春１３００４１；４．日本千叶大学真菌研究中心，日本千叶２６０－８６７３）［摘 要］ 目的：研究不同的提取方法对白假丝酵母和茄病镰刀菌胞内蛋白质浓度、种类及数量的影响，为建立一种稳定可靠的真菌胞内蛋白质提取方法提供依据。
方法：分别以白假丝酵母菌和茄病镰刀菌为研究对象，培养时间为３６、４８和７２ｈ，超声波工作时间为２０ｓ、３ｍｉｎ、５ｍｉｎ，１０ｍｉｎ，超声波功率为３３２．５和４７５．０Ｗ，通过蛋白质浓度检测和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ蛋白质电泳分析，比较不同条件下提取的蛋白质浓度、种类及数量，观察不同因素对蛋白质提取效果的影响。
结果：２株真菌均在培养３６ｈ时提取胞内蛋白质的浓度最大，白假丝酵母在功率３３２．５Ｗ、超声３ｍｉｎ时得到胞内蛋白质的数量和种类最多，茄病镰刀菌在功率３３２．５Ｗ、超声１０ｍｉｎ时得到蛋白质的数量和种类最多。
结论：使用超声波法与玻璃珠研磨法结合提取胞内蛋白质，从菌株的培养时间、超声波工作时间和功率３方面建立了真菌胞内蛋白质的最佳提取方法。
［关键词］ 白假丝酵母；茄病镰刀菌；超声波；培养时间［中图分类号］ Ｒ３７９．２ ［文献标志码］ ＡＥｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｓ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓＷＡＮＧ Ｓｈｕａｎｇ１，２，ＪＩＮＧ Ｌａｎ－ｘｉａｎｇ１，ＺＨＡＮＧ Ｙｕ２，３，ＨＥ Ｄａｎ２，ＴＩＡＮ Ｚｈｕａｎｇ２，ＧＡＯ Ｓｏｎｇ２，ＫＯＪＩ Ｙｏｋｏｙａｍａ４，ＷＡＮＧ Ｌｉ ２（１．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｄｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ １３００４１，Ｃｈｉｎａ；２．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｐａｔｈｏｇｅｎ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｎｏｒｍａｎ Ｂｅｔｈｕｎｅ Ｃｏｌｌｅｇｅ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００２１，Ｃｈｉｎａ；３．Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ，Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈａｎｇｃｈｕｎ１３００４１，Ｃｈｉｎａ；４．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｍｙｃｏｌｏｇｙ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｅｎｔｅｒ，Ｃｈｉｂｅｒ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｃｈｉｂａ ２６０－８６７３，Ｊａｐａｎ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ Ｔｏ ｓｔｕｄｙ ｔｈｅ ｅｆｆｅｃｔ ｏｆ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｃｕｌｔｉｖａｔｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｏｎ ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ，ｔｙｐｅ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｙ ｏｆ ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ａｎｄ ｔｏｐｒｏｖｉｄｅ ｔｈｅ ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｅｓｔａｂｌｉｓｈｉｎｇ ａ ｒｅｌｉａｂｌｅ ａｎｄ ｓｔａｂｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍｆｕｎｇｕｓ．Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ａｎｄ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ ｗｅｒｅ ｃｕｌｔｕｒｅｄ．Ｔｈｅ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｉｎｃｌｕｄｅｄ ｔｈｅｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ（３６，４８，ａｎｄ ７２ｈ），ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ（２０ｓ，３ｍｉｎ，５ｍｉｎ，ａｎｄ １０ｍｉｎ）ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ（３３２．５Ｗａｎｄ ４７５．０Ｗ）．Ｔｈｅ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓ，ｓｐｅｃｉｅｓ ａｎｄ ｑｕａｎｔｉｔｉｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｕｎｄｅｒ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｆａｃｔｏｒｓ ｗｅｒｅ ｄｅｔｅｃｔｅｄ ｂｙ ｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎ ｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ａｎｄ ＳＤＳ－ＰＡＧＥ ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ Ｂｏｔｈ ｓｔｒａｉｎｓ ｇｏｔ ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎ ｗｈｅｎ ｃｕｌｔｉｖａｔｅｄ ｆｏｒ ３６ｈ．Ｔｈｅ ｍｏｓｔ ｑｕａｎｔｉｔｙ ａｎｄ ｓｐｅｃｉｅｓ ｏｆ Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ ｗｅｒｅ ｏｂｔａｉｎｅｄ ｗｈｅｎ ｔｈｅｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ｗａｓ ３３２．５Ｗａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｔｉｍｅ ｗａｓ ３ｍｉｎ，ｂｕｔ ａｓ ｔｏ Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌｉｎａ，ｔｈｅ ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｐａｒａｍｅｔｅｒｓ ｗｅｒｅ ３３２．５Ｗａｎｄ １０ｍｉｎ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ Ｔｈｅ ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｉｓ ｅｘｔｒａｃｔｅｄ ｂｙｃｏｍｐｏｓｉｔｅｌｙ ｕｓｉｎｇ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｍｅｔｈｏｄ ａｎｄ ｇｌａｓｓ ｂｅａｄ ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｅ ｏｐｔｉｍａｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｍｅｔｈｏｄ ｏｆ０９５第３８卷 第３期２０１２年５月吉 林 大 学 学 报 （医 学 版）Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｊｉｌｉｎ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｍｅｄｉｃｉｎｅ Ｅｄｉｔｉｏｎ）Ｖｏｌ．３８Ｎｏ．３ Ｍａｙ ２０１２ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｐｒｏｔｅｉｎ ｆｒｏｍ ｆｕｎｇｕｓ ｉｓ ｄｅｖｅｌｏｐｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ａｓｐｅｃｔｓ ｏｆ ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ，ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃ ｐｏｗｅｒ ａｎｄ ｕｌｔｒａｓｏｎｉｃｗｏｒｋｉｎｇ ｔｉｍｅ ｏｆ ｓｔｒａｉｎｓ．Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｃａｎｄｉｄａ ａｌｂｉｃａｎｓ；Ｆｕｓａｒｉｕｍ ｓｏｌａｎｉ；ｕｌｔｒａｓｏｕｎｄ；ｃｕｌｔｕｒｅ ｔｉｍｅ 随着免疫力低下或免疫缺陷患者等易感人群的不断增加，条件致病性真菌感染的发生率呈上升趋势，严重威胁患者的健康和生命［１－２］，真菌致病和耐药机制的研究已成为当前研究的热点问题。
真菌感染性疾病的发生发展和抗真菌药物的作用，多数是在蛋白质水平上进行的［３］。
因此，在蛋白质水平上研究真菌的致病机制和耐药机制具有重大意义。
在真菌蛋白质组学研究中，获取相关胞内蛋白质是研究的首要问题。
真菌的细胞壁坚韧、不易被破碎，胞内蛋白质难以被释放，在破碎细胞壁的同时，如何减少胞内蛋白质损失非常关键。
目前，国内外常用的真菌破壁方法有超声波法、液氮冷冻研磨法和玻璃珠法等，其中超声波破壁操作简便，但是真菌破壁时间较长，超声工作时产生热量易引起蛋白质降解；液氮冷冻研磨在真菌的ＤＮＡ和蛋白质提取中均可应用，但液氮极易挥发，操作困难；而单纯玻璃珠研磨很难将菌丝体打散使细胞有效裂解。
也有部分研究者［４－６］制备原生质体提取蛋白质，但是其制备过程繁琐，得到数量很少，很难满足蛋白质研究需要。
本研究以２种较为常见的病原真菌白假丝酵母和茄病镰刀菌作为研究对象，联合使用几种破壁方法，在改变菌体培养时间、超声波功率以及工作时间３个条件下，比较不同提取条件下得到的胞内蛋白质浓度、种类及数量，旨在建立一种稳定、可靠的真菌胞内蛋白质提取方法。
１ 材料与方法１．１ 菌株、试剂与仪器 白假丝酵母ＪＬＣ ３０６９９和茄病镰刀菌ＪＬＣ ３０８７９均为临床分离株，由吉林大学真菌研究中心保藏。
ＨＺＱ全温震荡培养箱购自哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；冷冻高速离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ Ｂｉｏｆｕｇｅ Ｐｒｉｍｏｒ）购自力康生物发展有限公司；电子分析天平（ＡＢ２０４－Ｎ）购自梅特勒－托利多仪器上海有限公司；超声波细胞粉碎机（ＳＣＩＥＮＴＺ ＩＩＤ）购自宁波新芝生物科技股份有限公司；紫外分光光度计（Ｂｅｃｋｍａｎ ＤＵ ６００）购自美国Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ公司；马铃薯葡萄糖琼脂培养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ａｇａｒ，ＰＤＡ）、马铃薯葡萄糖液体培养基（ｐｏｔａｔｏ ｄｅｘｔｒｏｓｅ ｂｒｏｔｈ，ＰＤＢ）购自美国Ｄｉｆｃｏ公司；尿素、硫脲、二硫苏糖醇（ＤＴＴ）、３－［３－（胆酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸内盐（ＣＨＡＰＳ）、苯甲基磺酰氟（ＰＭＳＦ）、蛋白纯化试剂盒Ｃｌｅａｎ－ｕｐｋｉｔ等试剂购自美国Ａｍｅｒｓｈａｍ－Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司。
１．２ 菌株的培养 白假丝酵母在ＰＤＡ斜面培养基上３７℃培养２４～４８ｈ，茄病镰刀菌在ＰＤＡ斜面培养基上２８℃培养３～５ｄ。
用无菌的生理盐水将其制备成浓度为１×１０７ ＣＦＵ·ｍＬ－１的菌悬液。
各取３０μＬ分别接种于３０ｍＬ ＰＤＢ液体培养基中，分别在３７℃和２８℃振荡培养３６～７２ｈ。
１．３ 胞内蛋白质的提取 分别于培养３６、４８和７２ｈ后，以３ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ收集菌体。
无菌蒸馏水洗涤菌体３次，３ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，弃上清。
每２００ｍｇ菌体（湿重）加１００μＬ蛋白质提取液Ⅰ（７．５ｍｏｌ·Ｌ－１尿素、２．５ｍｏｌ·Ｌ－１硫脲、２０．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＰＭＳＦ、１．５ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＥＤＴＡ、１０．０ｍｍｏｌ·Ｌ－１ Ｔｒｉｓ、２０．０ｍｇ·Ｌ－１Ｄｎａｓｅ、５．０ｍｇ·Ｌ－１ Ｒｎａｓｅ，ｐＨ ７．４），室温作用２０ｍｉｎ后；降温至０℃后，以３３２．５Ｗ功率超声５ｍｉｎ，得到混合液。
再加入３００ｍｇ酸洗玻璃珠（玻璃珠直径≥０．５ｍｍ），充分研磨１０ｍｉｎ后，１ ８００ｒ·ｍｉｎ－１涡旋振荡１０ｍｉｎ；然后加入２５μＬ蛋白质提取液Ⅱ（２％ＣＨＡＰＳ，１％ＤＴＴ，ｐＨ ９．０），涡旋振荡３０ｓ后，置于冰上１ｍｉｎ，该步骤重复６次。
１４ ０００ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ，留取上清。