［ ］ $ ） 法 。目前经与小鼠颅日龄小鼠， ) * 的分离率， ; ( 检出率 ［ ］ 达+ + *+。 ! ) *脑悬液样品离心去除大组织块后接种于 培养! 冷丙酮固定细胞， 用荧光素 LS .细胞， C O后， 标记的抗狂犬病毒核蛋白抗体染色， 荧光阳性者即 表明检测样品中含有狂犬病毒。但并不是所有的 同一街毒样品在不 LS .细胞的检测灵敏度都一致， ［ ］ 同的 L S .细胞中的感染率为! ) *! D " *不等 IJ+ 。 特点： 耗时短， 配合免疫荧光法 " 该方法敏感， 可进行特异性快速诊断； # 需在具备组织培养条件 的实验室中进行； ／ ； $ 成本仅为 L ; ( 的! " % 适于 大样本量的检测； 如果样品严重污染细菌或腐败， & 致使样品中病毒失活， 会导致分离病毒失败。 狂犬病实验室诊断结果的得出要尽可能地快， 这不仅对暴露病人的暴露后治疗非常重要， 对受暴 露驯养动物采取预防措施同样重要， 因此只能保留 快速诊断方法。可依据敏感性、 特异性和花费选一 种或几种方法常规使用。直接 & ’ ( 检测狂犬病毒 抗原是最好的方法， 快速、 费用低， 且敏感性和特异
中国计划免疫A / / 1年?月第6 6卷第A期
・6 ? 7・ 实验中需要制备中和用狂犬病毒 + ， 病毒 < = : 6 6
8 荧光灶 滴度不得 "6 ／ 。另外还需要制备已知 / 3 4
性高。! 有非常 ! " # $ 试验是一个快速的诊断方法， 好的敏感性和特异性。跟 % 即使标本的运 & ’ 一样， 输条 件 不 太 好， 也 不 会 过 多 影 响 结 果。 另 外， ! ! " # $ 也与脑标本快速收集方法相适应。我们推 荐新狂犬病诊断的实验室使用 ! ! " # $。用 () *细 胞的狂犬病组织培养感染试验 （+ 非常敏感和特 # ’） 异， 由于能在短时间内得出结果， + # ’ 可替代动物 （成年或新生小鼠） 分离病毒的方法。 ! 狂犬病毒抗体的检测 滴定抗狂犬病抗体是为了测定接种对象在暴露 后治疗末期或暴露前免疫的抗体水平。世界卫生组 织 （,狂犬病专家委员会认为， 血清中的中和抗 .） 体! （ ／ / 0 1国际单位 # 2） 3 4才具有足够的保护性， 如果效价 "/ ／ ， 必须给予加强剂量， 直到抗 0 1 # 2 3 4 体达到要求的水平。也可在血库中进行抗体滴定以 筛选来自免疫供体的血浆样品， 用以制备治疗用人 狂犬病免疫球蛋白 （。特异狂犬病抗体的检测 ! # 5） 也有利于不明原因病毒性脑炎病人的病原学诊断。 6 7 8 9 年第七届 ,. 狂犬病专家委员会推荐 的标准检测方法有小鼠中和试验 （() 、 空斑减少 ’） 试验， 亦即随后发展成的快速荧光灶抑制试验 （! % : 。! 其敏感度 % # ’） % % # ’ 为现代实验室的首选方法， 至少与 () ’ 一致。 9 0 6 () ’ 毒， 与待滴定的系列稀释血清孵育， 试验中需设已知 效价的参照血清。然后将病毒 ／ 血清混合物经脑内 注射初成年小鼠， 计算死亡率和保护 1 / ; 动物的血 清稀释度， 根据参照血清的效价计算待检血清的效 价单位。 特点： !可定量检测狂犬病毒中和抗体效价； " 需预先制备中和用病毒 + ， 并滴定其半数致死剂 < = 量 （> ， 需专门技术培训， 操作较繁琐； $ #需6 ? @ 1 /） 出结果， 耗时长， 不利于快速诊断； $ 需较多试验小 鼠， 成本高； %动物间的个体差异会影响试验结果。 剂量固定、 已适应细胞 9 0 A ! % % # ’ 将预先滴定、 培养的标准攻击毒株 （+ ） ， 与 9 倍系列稀释的 < = : 6 6 待检血清9 ， 试验中需设已知效价的参照 8 B中和6 C 血清， 再加入敏感细胞悬液， 如果血清中抗体量少或 无， 则未 被 中 和 的 残 余 病 毒 感 染 细 胞， 经9 8 B1 ; ， 细胞单层用冷丙酮固定， 加荧 + . ? C A 环境中培养A 光标记的抗核衣壳抗体染色， 即可出现荧光灶。如 果血清中和抗体很多， 将病毒完全中和， 则无病毒感 染细胞， 荧光抗体染色为阴性。通过计算可得出待 检血清中和抗体效价。 将一定量预先滴定好的标准攻击病
［ ］ # ， 能检测到的基因
鼠脑组织中的狂犬病毒。 适于不具备组 L ; ( 法的特点： " 该方法敏感， 织培养条件的实验室分离狂犬病毒街毒； # 耗时较 长， 仅凭动物发病症状不足以确定为狂犬病毒， 需配 合免疫荧光法作特异性鉴定。 $ , # 细胞培养分离技术 （N 3 F F 7 ? < F > < B 3; 4 = F . > 0 = 6 ， 各实 ( 3 ? O 6 0 < 3 4 N ; (） $ ) 世纪 I ) 年代中期以来， P 验室相继用地鼠肾传代细胞 （M ） 、 鸡胚细胞、 小 Q R $ ! 鼠成神经瘤 （LS ） 细胞分离街毒狂犬病毒。与小 . 鼠颅内接种法相比所需时间大大缩短， 但M 细 Q R $ ! 胞分离街毒的敏感性比小鼠颅内接种法低。有人对 结果证明小鼠 N ; (、 L ; (、 & ’ ( 法做了大量的比较， LS .细胞分离街毒的敏感性不低于小鼠颅内接种
收稿日期： ； 修回日期： ( # # ! , ’ # , # * ( # # ! , ’ ( , " # 作者简介： 徐葛林 （ ， 女， 上海市人， 武汉生物制品研究所 ’ * $ " ,） 副研究员， 博士， 主要从事狂犬病病毒及其抗体的诊断及分子流行病 学研究。
制成脑印片， 室温干燥后浸入丙酮" ， 取出晾干 # 0 1 2 即可用于荧光抗体实验。取印片剩余的脑组织用含 ’ # 3灭活小牛血清的细胞培养液研磨成 " # 3 匀浆 （4 ／ ） ， ， 取上清用于狂犬病毒抗 5 (# # # # 0 1 2 6离心 " 原的其它检测方法。 ( 7 ’ 荧光抗体实验 （8 ， 9 : ; < = > ? = 2 @A 2 @ 1 B ; C = > @ DE 8 A E） 狂犬病毒感染的细胞内有由狂犬病毒核衣 壳聚集形成的包涵体。以提纯的狂犬病毒核衣壳免 疫实验动物制备的多克隆抗体， 或抗核衣壳单克隆 抗体 （单抗） 与异硫氰酸荧光素偶联后， 用直接免疫 荧光法可特异地与这些包涵体结合， 该方法是狂犬
［ ， ］ I C 法 。如果接种物中含有少量的街毒， 颅内接种
! 型狂犬病
毒最小核衣壳抗原量为) ／ , C ! ! , ) 6 : F E
［ ］ " 。
徐葛林等用抗狂犬病毒核蛋白的单抗建立了用 于检测狂犬病毒抗原的双抗体夹心酶联免疫吸附试 验 （5 G ; H ’ & ’ ( 法相比较， 检测了近!) 份动物脑组织， 结果完全 ) ) 一致。该试剂盒对基因!型的狂犬病毒检出灵敏度 达到 ) ／ ， 对狂犬病街毒 I 个基因型均 能 检 , C 6 : F E 出。 技术特点及要求： 本方法具有灵敏度高、 特异性 好、 操作简单、 重复性好、 不需要昂贵仪器等特点， 最 适合于作现场流行病学调查， 也可作为狂犬病疫苗 或狂犬病毒的鉴别诊断。本试剂盒中酶标板包被后 需立即使用或保存于J $ ) K备用。肉眼观察阳性对 照显黄颜色， 阴性对照完全无色。所有显色样品， 无 论深浅均认为是阳性。福尔马林固定的样品不适宜 作孵育及洗涤 5 ; @。使用酶标记抗体前的加样、 过程需要在 A %实验室中进行。 （L $ , % 小鼠颅内接种分离狂犬病毒法 ; (） 狂犬 病毒是嗜神经性病毒， 可采用颅内接种法分离后， 再 进行狂犬病特异性抗原的检查。可采用小白鼠接种 分离， 任何品种的实验用小白鼠均可使用， 一般选择 体重+!! 雌雄不限。如用 !!% ! E 的健康小白鼠， 日龄的乳鼠， 可提高病毒分离的阳性率。 可疑动物脑组织或唾液腺组织可用于病毒的分 离， 一般前者病毒检出率要高于后者， 但从流行病学 观点考虑， 检查唾液腺中的病毒更显重要。脑组织
・! # C・ 织， 结果发现在! 有"份为狂 " #份外观健康的犬中， 犬病毒抗原阳性， 通过乳鼠颅内接种已分离并证实
［ ， ］ $ % 为狂犬病街毒株 。
中国计划免疫$ ) ) "年#月第! !卷第$期
需要预先用含 ! * !" * 灭活牛血清的生理盐水或 A M H或 脱 脂 奶 研 磨 成 ! ) * 悬 液， ! " )!$ ) ) E离心 唾液腺需切碎后再研磨， " : 0 6去除粗颗粒； !!$ 层 无菌纱布过滤后， 颅内接种小鼠， ／ 只。 ) , ) % : F 逐日观察接种小鼠的体征， 小鼠颅内接种狂犬 病毒后潜伏期至少" ， 在此期间出现的死亡为非特 1 异性死亡， 主要原因是接种材料污染细菌、 接种时损 伤小鼠脑组织等。之后逐日记录小鼠正常、 发病、 死 亡数量及其病症， 其典型症状为竖毛， 镊子夹其尾部 倒提时出现震颤， 置于桌上时后腿运动失调、 麻痹、
中国计划免疫( # # &年!月第’ ’卷第(期
・’ ! .・
国内外狂犬病毒实验室检测与诊断技术的研究及进展
徐葛林
（武汉生物制品研究所， 湖北 武汉 ! ） " # # $ #
中图分类号： % & ’ ( ) * *
文献标识码： +
文章编号： （ ） ’ # # $ , * ’ $ ( # # & , # ( , # ’ ! . , # !
［ ］ D 直至死亡 。并用 & ’ ( 法检测所有死亡或发病小
对狂犬病疑似病人可取颈背部带有毛囊的皮 肤， 用& 抗原可在围绕毛囊的神经丛中 ’ ( 作活检， 找到， 皮肤活检的阳性率随病程而增多， 其敏感性为 特异性接近! " ) *! + # *， ) ) *。 （$ , $ 快速狂犬病酶免疫诊断法 . 0 1. 2 0 3 45 6 7 / ， 8 : 3 ; : : < 6 = 1 3 > 3 ? > 0 = 6 5 ; @） 5 ; @ 可通过检 9 测脑组织中的狂犬病毒核衣壳来诊断狂犬病。将标 本于缓冲液或组织培养液中研磨成匀浆， 离心取上 清， 置于微量反应板中孵育 （该板已用抗狂犬病毒核 衣壳抗体包被） ， 然后再用过氧化物酶标记的抗狂犬 病毒核衣壳抗体来检测被捕获的抗原， 加显色底物 进行酶促颜色反应。该方法由 A 3 B B 0 6A 于 ! + C D年 建立， 后经欧美 D 个实验室试验， 共检测了%) ) )多 个样品， 结果表明与 & （ ， ’ ( 有很好的相关性 + D *） 灵敏度略低于 & ’ (