董双，何剑斌，张燚，等．玉米赤霉烯酮对雄性小鼠生殖系统的毒性作用．［J］．畜牧与兽医，2016，48（6）：25－29Dong S，He J B，Long M，et al．Toxic effects of zearalenone on male reproductive system in mice［J］．Animal Husbandry＆Veterinary Medicine，2016，48（6）：25－29玉米赤霉烯酮对雄性小鼠生殖系统的毒性作用董双，何剑斌*，张燚，龙淼*（沈阳农业大学畜牧兽医学院，辽宁沈阳110866）摘要：为探讨玉米赤霉烯酮（ZEA）对雄性生殖系统的毒性作用，本试验选取清洁级昆明系雄性小鼠93只，随机分成5组：25mg/kg、50mg/ kg、75mg/kg ZEA处理组、溶剂对照组（DMSO）、空白对照组（生理盐水），进行腹腔注射染毒，每天1次，连续5d，于末次染毒后第2天摘眼球采血并脱颈处死动物，分离睾丸和附睾，测定脏器系数、精子密度和活力，睾丸酶的活力水平以及血清睾酮和雌激素的浓度。
结果显示，与对照组相比，玉米赤霉烯酮显著地降低小鼠的体重和精液品质，睾丸乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）的活力随着染毒剂量的增加显著升高（P＜0.01，P＜0.05），血清睾酮和雌激素浓度随染毒剂量的增加显著下降（P＜0.01，P＜0.05）。
该结果提示，玉米赤霉烯酮对雄性小鼠生殖系统具有严重的损伤作用，影响生精功能。
关键词：玉米赤霉烯酮；睾丸；附睾；精液品质中图分类号：S856.9文献标志码：A文章编号：0529－5130（2016）06－0025－05Toxic effects of zearalenone on male reproductive system in miceDONG Shuang，HE Jian－bin，LONG Miao，ZHANG Yi（College of Animal Science and Veterinary Medicine，Shenyang Agricultural University，Shenyang110866，China）Abstract：To examine toxic effects of zearalenone（ZEA）on male reproductive system，93clean grade adult male Kunming mice were ran-domly divided into5groups and exposed to intraperitoneal injection of ZEA at25，50and75mg/kg body weight，DMSO and normal saline solution，respectively for5days．The mice were sacrified at the6th day after eyeball blood sampling．The testis and epididymis viscera inde-xes，semen quality，testis enzyme activity and serum concentrations of testosterone and estrogen were assessed．The results showed that com-pared with the control group，ZEA significantly decreased the body weight，semen quality，increased the testis enzyme activity and decreased serum concentrations of testosterone and estrogen（P＜0.01，P＜0.05）．In conclusion，ZEA can hurt male reproductive system and affect the spermatogenic function．Key words：zearalenone；testis；epididymis；semen quality；testosterone玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEA）是由镰刀菌属的霉菌，如黄色镰孢霉、禾谷镰孢霉、轮枝镰孢霉产生的类雌激素作用的次级代谢产物，是一种大环β－二羟基苯甲酸内酯类［1－2］。
这种霉菌毒素存在于各类农作物中，如收割前后的小麦、大麦、玉米、高粱等，以及农产品加工阶段，进而污染世界范围内的人类食物和动物饲料，给全球带来巨大的经济损失。
ZEA不仅具有肝肾毒性、遗传毒性、免疫毒性，还收稿日期：2015－06－30基金项目：中国博士后科研基金项目（2014M551125）；国家自然科学基金项目（31201961、31302152）作者简介：董双（1989－），女，硕士生，研究方向：临床兽医学*通信作者：何剑斌（1969－），男，硕士生导师，教授，研究方向：临床兽医学，E－mail：hejianbin69@；龙淼（1978－），男，讲师，博士，研究方向：动物营养代谢病及中毒病，E－mail：longjlau@ 由于其能够与17β－雌二醇竞争性结合雌激素受体（EＲ），具有雌激素效应，干扰机体的内分泌系统，产生生殖毒性，进而影响动物的正常生理活动，引起靶器官、靶组织甚至机体的多个系统发生病变［3－5］，对人类和动物的健康危害极大。
ZEA作为一种外源性内分泌干扰物，其生殖毒性是当今科研领域的一大研究热点。
有研究显示，ZEA对机体的生殖系统损害极大［6］。
研究表明玉米赤霉烯酮呈剂量依赖性方式诱导猪卵巢颗粒细胞发生细胞凋亡和细胞坏死，从而减少细胞的增殖［7］，还能够引起断奶仔猪发生氧化损伤和炎症反应［8］，并且玉米赤霉烯酮还使断奶雌鼠的初情期提前，并干扰雌鼠的早期妊娠［9］。
ZEA不仅影响雌性动物的繁殖机能，还损害雄性动物的生殖系统，能够引起大鼠的睾丸萎缩，并诱导生精细胞发生凋亡［10］，睾丸间质细胞发生凋亡和细胞自噬［11］，且抑制睾酮的分泌［12］，从而影响精子的生成，导致潜在的生殖问题。
国内外学者做了大量的体内体外试验，以期揭示出ZEA生殖毒性的作用机制，然而，关于ZEA对雄性生殖毒性的研究相对较少。
因此，我们通过检测小鼠睾丸和附睾脏器系数、精液品质、睾丸关键性酶活力的水平以及血清睾酮和雌激素的质量浓度，就ZEA对雄性生殖系统的毒性作用进行初步研究，为进一步探讨其毒性作用机制提供有力参考。
1材料与方法1.1试验动物健康清洁级的昆明系雄性小鼠95只，8周龄，体重为40－45g，购自辽宁长生生物技术有限公司。
小鼠食用同种灭菌饲料，自由饮水和采食，定期添加饲料和饮用水，并更换垫料和清洁粪便，每天光照12h，适应性饲养1周，无异常后进行试验。
1.2药品和试剂ZEA和二甲基亚砜（DMSO）均购自美国Sigma 公司。
乳酸脱氢酶（LDH）、碱性磷酸酶（AKP）、酸性磷酸酶（ACP）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所。
血清睾酮和雌二醇放射性免疫试剂盒购自北京北方生物技术研究所。
1.3分组和染毒将93只雄性昆明小鼠随机分成5组，第1组为空白对照组10只；第2组为溶剂对照组10只，腹腔注射DMSO和生理盐水的混合液；第3组25只、第4组25只和第5组25只为ZEA处理组，分别腹腔注射25mg/kg、50mg/kg、75mg/kgZEA。
每天1次，连续染毒5d，根据体重增减染毒剂量。
1.4样本采集于末次染毒后第2天，对小鼠进行摘眼球采血与脱颈处死，分离两侧睾丸和附睾，并称重。
每组取4只小鼠的左侧睾丸放入4%中性甲醛溶液中固定，其余睾丸经液氮冻存后，转移至－80ħ超低温冰箱中保存。
双侧附睾需立即放入2mL37ħ预热的生理盐水中，进行精子计数和活力检查。
小鼠的血液室温下静置1h，3000r/min离心15min后收集血清于－20ħ保存。
1.5小鼠的行为观察和睾丸与附睾的脏器指数每天观察动物的采食、饮水、行为活动、毛色、尿液和粪便等有无异常，染毒前后各测定体重一次，以观察ZEA对小鼠生长状况的影响。
于末次染毒后剖检那一天称量小鼠的体重，脱颈处死后，分离睾丸和附睾并称重，计算脏器系数。
脏器指数（%）=脏器重量（g）/小鼠体重（g）ˑ100。
1.6精液品质的检测精子活力的检测：采取两侧附睾，立即置于2 mL37ħ预热的生理盐水中剪碎，吸管吹打混匀，制备成精子悬液，置于37ħ水浴锅中孵育20min后，取1滴悬液置于37ħ预热的清洁的血细胞计数板上，盖上盖玻片，在高倍镜下连续计数200个精子，精子活力分级依照WHO对精子的分级标准，分为：Ⅰ快速直线的向前运动；Ⅱ慢速或迟钝的直线或非直线向前运动；Ⅲ不向前的运动；Ⅳ不活动。
整个操作和观察在室温下进行，并在10min内结束。
精子活动度（%）=（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ）/（Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ+Ⅳ）ˑ100%。
精子计数：将余下的精子悬液置于60ħ水浴中处死精子。
吸取一滴精子悬液于血细胞计数板的计数池内，按照红细胞计数法，计数5个中方格内的精子总数，记为n a，按下列公式计算精子总数N a（106/ mL）=naˑ100000。
精子畸形的观察：取精子悬液一滴，用2%伊红染色5min，制成精液涂片，晾干后，甲醇固定，晾干后高倍镜下观察畸形精子。
1.7睾丸标志酶的活力检测取－80ħ冰箱保存的睾丸，每组5个，严格按照试剂盒说明书配制试剂并制备组织匀浆液，按要求检测LDH、AKP、ACP的活力。
1.8血清睾酮和雌二醇的浓度从－20ħ冰箱中取出血清，恢复至室温后，严格按照试剂盒说明操作，制作标准曲线，检测血清睾酮和雌二醇的浓度，由中国医科大学实验室协助完成。
1.9统计学处理采用SPSS17.0软件进行数据分析，实验数据以均数ʃ标准误表示，P＜0.05具有统计学意义。
2结果2.1行为观察和成活率在染毒期间，空白对照组和溶剂对照组的小鼠采食和饮水正常，尿液和粪便正常，毛色光滑，活动灵敏；而ZEA处理组的小鼠反应迟钝，少动，精神不振，毛色光泽度降低，较少采食和饮水，有的表现为肌肉震颤，走路不稳，严重者在染毒第4天死亡。
各组动物死亡情况如表1所示。
表1各试验组小鼠死亡情况组别动物数/只死亡动物数/只空白对照组100溶剂对照组100低剂量组251中剂量组258高剂量组2510如表2所示，每组随机抽取5只小鼠，各试验组小鼠在染毒5d前后的体重变化。
在连续染毒5d后，ZEA各处理组小鼠的体重均下降，但中剂量组（50 mg/kg）体重下降不明显，低剂量（25mg/kg ZEA）和高剂量（75mg/kg ZEA）组的小鼠体重与空白对照组相比，明显降低（P＜0.05），尤其是高剂量组（P＜0.01）。