1 前言
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1.1 定义
无菌检查法系用于检查药典要求无菌的药
品、原料、辅料及其他品种是否无菌的一种方
法。若供试品符合无菌检查法的规定，仅表明
了供试品在该检验条件下未发现微生物污染。
1.2 实验环境条件要求 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
无菌检查应在环境洁净度10 000级下的 局部洁净度100级的单向流空气区域内或隔 离系统中进行，其全过程必须严格遵守无 菌操作，防止微生物污染。单向流空气区、 工作台面及环境应定期按《医药工业洁净 室(区)悬浮粒子、浮游菌和沉降菌的测试方 法》的现行国家标准进行洁净度验证。隔 离系统按相关的要求进行验证，其内部环 境的洁净度须符合无菌检查的要求。
2.3 培养温度 硫乙醇酸盐流体培养基置30～35℃培养。
改良马丁培养基置23～28℃培养。 2.4 培养基的适用性检查
无菌检查用的硫乙醇酸盐流体培养基及改 良马丁培养基等应符合培养基的无菌性检查 及灵敏度检查的要求。
2.4.1无菌性检查 每批培养基随机取不少于5支(瓶)，培养14 天，应无菌生长。
2. 培养基
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2.1 培养基的灭菌 配制后应采用验证合格的灭菌程序灭菌。
2.2 培养基的保存 制备好的培养基应保存在2～25℃、避光的
环境。培养基若保存于非密闭容器中，一般在三 周内使用；若保存于密闭容器中一般可在一年内 使用。
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4.1 菌种
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1）金黄色葡萄球菌
(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26 003]
2）铜绿假单胞菌
(Pseudomonasaerugznosa)[CMCC(B)10 104]
3）枯草芽孢杆菌
(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63 501]
4）生孢梭菌
(Clostridiumsporogenes)[CMCC(B)64 941]
5）白色念珠菌
(Candidaalbicans)[CMCC(F)98 001]
6）黑曲霉
(Aspergillusniger)[CMCC(F)98 003]
4.2 菌液制备
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制备的菌液，一般当日使用。
4. 方法验证试验
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目的: 1)证明所采用的方法适合于该药品的无 菌检查
2) 确认供试品在该实验条件下无抑菌 活性或其抑菌活性可以忽略不计。
3) 确保在实际检验条件下，该供试品 的无菌检查法的准确性、有效性和重现性。
验证时，按“供试品的无菌检查”的规定 及下列要求进行操作。对每一试验菌应逐一进 行验证。
各试验菌及相应的培养基逐一进行验证。
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加
供
试
金 葡
铜 绿
白 念
品
枯
生
黑
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霉
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4.4 直接接种法
取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙 醇酸盐流体培养基8管，分别接人小于 l00cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；
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金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、 枯草芽孢 杆菌、生孢梭菌接种至硫乙醇酸盐流体培养 基中30～35℃培养3天；
白色念珠菌、黑曲霉接种至改良马丁培养基 中23～28℃培养5天。
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3. 稀释液、冲洗液及其制备方法 0.1％蛋白胨水溶液 pH7.0氯化钠—蛋白胨缓冲液
如含供试品的任一容器中微生物生长微 弱、缓慢或不生长，则供试品的该检验量在 该检验条件下有抑菌作用，可采用1)增加冲 洗量，或增加培养基的用量，2)使用中和剂， 或更换滤膜品种等方法，消除供试品的抑菌 作用，并重新进行方法验证。
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5. 供试品的无菌检查 5.1 无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种 法。只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤 法。进行供试品无菌检查时，所采用的检验 方法和检验条件应与验证的方法相同
取符合直接接种法培养基用量要求的改良 马丁培养基4管，分别接入小于l00cfu的白 色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接人规定 量的供试品，另1管作为对照，按规定的温度 培养3～5天。
4.5 结果判断 资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
与对照管比较，如含供试品各容器中的 试验菌均生长良好，则供试品的该检验量在 该检验条件下无抑菌作用或其抑菌作用可以 忽略不计，照此检查法和检验条件进行供试 品的无菌检查。
黑曲霉
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改良马丁琼脂斜面培养基上， 23～28℃培养5～7天，
加入3～5ml 0.9％无菌氯化钠溶液，将孢子洗
脱
吸出孢子悬液(用管口带有薄的无菌
棉花或纱布能过滤菌丝的无菌毛细吸管)至无菌
试管内
用0.9％无菌氯化钠溶液制成每lml含孢
子数小于l00cfu的孢子悬液。
菌种
菌株传代次数 培养基接种结判断资料仅供参考,不当之处，请联系改正。
2.4.2 灵敏度检查
金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞 菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、 白色念珠菌、黑曲霉
不得超过5代
每种菌接种至2管相应的培养基， 另取一支不接种作空白对照，按 规定温度时间培养。
空白对照管应无菌生长，每种 菌接种后的2管培养基管均生长 良好，该培养基的灵敏度检查符 合规定。
4.3 薄膜过滤法
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将规定量的供试品按薄膜过滤法过滤，冲
洗，在最后一次的冲洗液中加入试验菌（小于
100cfu），过滤。取出滤膜接种至相应的培 养基中，或将培养基加至滤筒内。
另取一滤桶，不过滤供试品，其它操作同 上，作为对照.
将含培养基的容器按规定温度培养3～5天。
金黄色葡萄球菌（铜绿假单胞菌、枯草芽 孢杆菌) 营养肉汤（或营养琼脂培养基）
生孢梭菌 硫乙醇酸盐流体培养基
30～35℃培养18～24小时；
白色念珠菌 改良马丁培养基（或改良 马丁琼脂培养基）
23～28℃培养24～48小时
上述培养物 用0.9％无菌氯化钠溶液制成每 1ml含菌数小于l00cfu(菌落形成单位)的菌悬 液。