动物线粒体D NA 提取的原理和方法*X夏玉玲 刘彦群 鲁 成X X (西南农业大学蚕学与生物技术学院农业部蚕桑学重点实验室 重庆 400716)摘 要 从动物线粒体的特征、线粒体的鉴定方法、提取线粒体D NA 各步骤等原理出发,比较了目前常用的几种提取线粒体D N A 的方法,提出动物线粒体D N A 提取的几点关键步骤,并提出一套优化的操作流程。

关键词 线粒体 线粒体D N A 提取方法线粒体是存在于绝大多数真核细胞内的一种基本的重要的细胞器。

它是细胞进行氧化磷酸化的场所。

线粒体基因组不仅是研究D N A 结构与复制转录的良好模型,也是研究真核细胞核酸与蛋白质合成非常合适的模型系统。

线粒体基因组与核基因组的同源基因结构对比也被广泛应用于核基因和核外基因的进化研究中。

由于线粒体基因在真核生物具有高保守性,所以它已成为了研究物种进化的一种常用的标记,并为线粒体起源提供有价值的线索[1]。

动物线粒体D NA 具有分子量小、结构简单、母性遗传和进化速度快等特点,已广泛应用于动物群体遗传学和进化生物学等领域的研究[2]。

进行动物线粒体D NA 方面意义重大,现将线粒体D N A 的提取的原理和方法介绍如下:1 提取动物线粒体D N A 的原理1.1 线粒体的特征线粒体是由内外两层膜组成,外膜光滑,内膜向内回旋折叠,形成许多横隔。

线粒体中含有多种氧化酶,在此进行TCA 循环、呼吸连电子传递和氧化磷酸化等产能作用,并传递和储存所产生的能量,是细胞的动力工厂和生物氧化的主要场所。

线粒体的形状、大小、数目和组成,在不同生物、不同组织以及生活于不同条件下的细胞中变化很大。

线粒体的外型呈多样化,绝大多数类型细胞呈圆形、卵原形,也有呈杆状的。

其体积大小不等,一般直径比较一致,为0.5~1.0L m,长度为1~5L m,最长可达到7L m 。

线粒体的数目与生物种类、组织、细胞类型和细胞生理功能变化有关。

锥虫和有的真菌只有一个线粒体,大多数动物的肝脏细胞含有上千个线粒体,生殖细胞如卵母细胞可达到30万个线粒体,家蚕的每个后部丝腺细胞只有2~4个线粒体[13],而有的细胞根本没有线粒体;在细胞生命活动旺盛时,它的数量多,在衰老时,数量少,有时可能消失;新生细胞比衰老细胞或病变细胞的线粒体多。

线粒体的主要成分是蛋白质(占干重60~65%)和脂类(占干重35~40%)。

此外还有少量的核酸(主要为D NA 和RNA)、金属离子、阴离子和维生素等。

其中线粒体膜主要成分是蛋白质、脂类和一些酶,基质由各种酶、D N A 、RNA 、金属离子、阴离子和维生素等组成。

mtD N A 不24蚕 学 通 讯Ne wsletter of Sericultural Science 第22卷 第3期2002年 9月X X X 通讯作者国家自然科学基金项目资助(项目编号:30170719)与组蛋白相结合,它们排列紧密,而象细菌体那样形成为环状裸露的双链D N A 。

不同物种的线粒体基因组D N A 大小悬殊。

一般植物的线粒体基因组D N A 较大,其分子大小范围为:186~2400kb;原生动物线粒体基因组D N A 为18.5~55kb;真菌的线粒体基因组D NA 大小在17.6~115kb 之间;动物线粒体基因组D N A 较小,约为15.7~19.5kb 。

线粒体在功能上受核制约,mtD NA 的复制、转录和翻译过程离不开核基因组的指导与调控。

但它有一套自主装置的基本成分,如D NA 聚合酶、RN A 、RN A 聚合酶、tRNA 、核糖体核氨基酸活化酶等,所以mtD NA 不仅能进行自我复制,还能编码合成2种rRNA 、22种tRNA 和13个蛋白质[1]。

正常的动物线粒体寿命一般仅为1周时间。

离体的线粒体在低温下(0~8e )其活性可以保存3~7d,而在常温下(25e )只能保存1~2h[2]。

1.2 线粒体的鉴定Janus Green B 是对线粒体专一的活性染料,具有脂溶性,能跨过细胞膜,有染色能力的基团带正电,结合在负电性的线粒体内膜上,内膜的细胞色素氧化酶使染料保持氧化状态,呈现蓝绿色,而在胞质内,染料被还原成无色。

线粒体浸没在Janus Green B 中能维持活性数小时,可直接观察到生活状态线粒体的外形、分布及运动。

线粒体制品经Janus Green B 特意染色后,光学显微镜下放大100倍镜检能够发现是否有线粒体存在及它的大小、形状、数量、结构[3]。

1.3 线粒体的获得1.3.1 细胞器的游离[6,7]细胞器的游离需要破碎细胞,破碎细胞常用的方法有化学法和机械法。

化学法有渗透压作用、酶水解、自溶、冻融等几种类型。

渗透压作用是利用低表面张力使细胞膜破碎,其作用温和。

自溶法是利用生物自生的活细胞内含有各种大量的消化酶,它们能将细胞膜溶解掉,同时也可能将线粒体膜溶解而使线粒体D N A 释放出来。

冻融法是利用冻结和溶解的双重作用,其作用可能会造成细胞膜和有膜结构的细胞器的破裂,其作用较为剧烈。

机械法有研磨破碎、均质机破碎、超声波破碎和匀浆器破碎。

研磨破碎是利用盘磨研磨剪切破碎,作用中等。

均质机破碎是用电带动刀片进行剪切组织器官,其作用较剧烈,基本能够将组织器官破碎。

超声波破碎是随机地将组织细胞打成各种大小不同的片段,其作用非常剧烈。

匀浆器破碎是一种手动的方法,由于匀浆器容器壁较为粗糙,通过相互的摩擦,基本能将细胞膜磨破,其作用温和。

要获得较为完整而大量的线粒体,通常用S TE 抽提缓冲液浸泡材料并用玻璃匀浆器或研钵研磨破碎[3~6]。

1.3.2 线粒体的粗提由于动物细胞的线粒体较小,而真核细胞及其碎片、蛋白质沉淀物都比较大,所以用差速离心的方法可以将它们分离开来。

差速离心法又叫分级离心法,是当非均一粒子(大小、密度各不相同)的悬浮液被离心时,各种粒子将以各自的沉降速率移至离心管底部,逐步在管底形成沉淀。

为了分出特定组分,需进行一系列离心。

首先选择一个离心速度和离心时间,第一次离心时把大部分不需要的更大粒子沉降去掉。

这时所需要的组分大部分还留在上清液中,又选择第二个离心速度和离心时间,使大部分不需要的更小的粒子留在上清液。

去掉上清液后,添加相同介质把沉淀悬浮起来,重复上述的差速离心,反复几次,直至达到所需要的粒子纯度为止。

253期 夏玉玲等:动物线粒体D N A 提取的原理和方法26蚕学通讯22卷通常用相对离心力(RC F)将粒子沉淀下来。

而相对离心力的大小取决于试样所处的位置至轴心的水平距离即旋转半径R和转速n,其计算公式为:RCF=1.118@10-5n2R(g)n)))转速(r/min)R)))旋转半径(cm)混合液中粒子分离、沉淀所需时间(Ts)的计算公式为:Ts=27.4(logR max-logR mi n)L n2r2(R-Q)R max)))离心试液的底至轴心的水平距离(cm)R min)))离心试液的面至轴心的水平距离(c m)r)))粒子半径(cm)R)))粒子密度(g/cm3)Q)))混合液密度(g/c m3)L)))混合液粘度(p o)以上两个公式就能确定各种差速离心的离心力和离心时间。

一般去细胞碎片及杂质的离心力(500~2000g)和离心时间(5~15min),沉淀线粒体的离心力(12000~20000g)和离心时间(20~40min)。

1.4线粒体D N A的获得1.4.1线粒体D N A的粗制提取线粒体D NA首先需要破碎线粒体膜将其D NA释放出来。

溶液Ò(0.2mol/L NaO H -1%SD S)的1%SD S能够破碎线粒体膜,使线粒体D N A释放出来;0.2mol/L NaO H提供了一个强碱环境,使基因组D NA和线粒体D N A的氢键都发生断裂而变性。

溶液Ó(K Ac-HAc或NaAc-HAc缓冲液)呈酸性,可以中和溶液II的强碱性而使溶液呈中性,便于线粒体D NA复性,而基因组D NA不能复性。

复性的线粒体D N A溶于水溶液中,不能复性的基因组D NA形成沉淀,通过离心可将两者分离开来。

之后用0.6倍体积的异丙醇或2~2.5倍体积的无水乙醇沉淀线粒体D NA。

1.4.2线粒体D N A的纯化[8]要获得较为纯净的线粒体D N A就必须去除蛋白质和脂类、金属离子、阴离子和维生素等其它几种物质。

首先,加RNase(200L g/mL)37e、2~4hr消化RNA。

之后,用酚、酚\氯仿\异戊醇(体积比为25:24:1)、氯仿抽提D N A以去除蛋白质、脂类等其它物质。

1.4.3线粒体D N A的沉淀、溶解与检测纯化后的线粒体D N A量较少,用异丙醇或沉淀缓冲液沉淀。

线粒体D N A溶液加入0.6倍体积异丙醇或沉淀缓冲液,置于-20e下放置30min,进行离心即得纯净的线粒体D NA。

之后,用70%乙醇洗涤两次,于真空中干燥20min或风干。

加入适量的TE溶液(PH8.0)溶解线粒体D N A。

检测线粒体D NA浓度和纯度通常有3种方法,即琼脂糖凝胶电泳(AG E)、限制性内切酶酶切和紫外分光光度计(U V)。

琼脂糖凝胶电泳可以通过泳带颜色的深浅来判断其浓度,通过是否有拖带来确定其纯度,还可以通过分子量标记来确定线粒体D N A的大小。

限制性内切酶酶切可以知道是否为基因组,如果是基因组,则不能酶切出清晰的条带来;如果没有基因组污染,只要该线粒体D NA存在此酶切位点,就会酶切出条带来。

紫外分光光度计可以测得A260和A260/A280,其中A260越大,其D N A的浓度也越大,反之越小。

A260/A280一般介于1.6~2.0之间,如果A260/A280>2.0,则此D N A可能有RN A污染,A260/A280<1.6,则此D N A可能有蛋白质、酚、氯仿或乙醇等的污染。

2常用的几种提取方法及优缺点2.1动物线粒体D N A的提取方法关于动物线粒体D NA的提取方法,主要有:(1)氯化铯密度梯度离心法;(2)柱层析法;(3)D Nase法柱层析法;(4)碱变性法;(5)改良的碱变性法。

2.1.1氯化铯密度梯度离心法[9]密度梯度离心法是把样品粒子在一个密度梯度介质中离心,这个介质由一个合适的小分子及其溶剂组成。

离心时,离轴心越远介质密度越大。

氯化铯密度梯度离心法就是以氯化铯为介质将各组分分离出来。

此方法具有良好的分辨能力,可以同时使样品中几个或全部组分分离,以前常用于线粒体的分离。

2.1.2柱层析法[10]层析分离技术是一种物理的分离方法,它利用混合物中的各组分物理化学性质的差别(如吸附力、分子形状和大小、分子极性、分子亲和力、分配系数等),各组分以不同程度分布在两相中,从而使各组分以不同速度移动而达到分离。