第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
全酶在DNA上的装配分为三个阶段： 一个β二聚体上加上一个γ复合体识别引物模板 形成一种前起始复合物 DNA由于β、 γ复合体结合的位点构象发生改变， 而对核心酶产生了高亲和 ζ二聚体结合核心聚合酶，使其发生聚合
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DNA聚合酶III的成分与功能
第四节 原核生物复制的酶系统
DNA聚合酶 III 的组成
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
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复制酶作用模型
解旋酶形成复制叉，解旋酶 一般为六聚体环状结构，并 在后随链的模板上，以5‘-3’ 方向移动。 解旋酶和DNA聚合酶的两个 催化亚基相连
一、研究方法： 同位素标记电镜观察及变性法 噬菌体插入标记法 • 同步培养 • 不同步培养 变性定性法 双向电泳法
第二节 复制的起点、方向和终点
第二节 复制的起点、方向和终点
大肠杆菌染色体的Mu噬菌体插入位置
第二节 复制的起点、方向和终点
第二节 复制的起点、方向和终点
二、原核染色体的复制起点和方向 E.Coli 定点、双向对称复制 T7在近一端的17%处开始，向两端延伸 枯草杆菌有固定的起始点、双向不对称复制 质粒R6K早期为单向复制，复制了约1/5基因组时改 为双向复制 质粒Col E1 有固定起始点，为单向复制 Mt DNA进行D（displaced loop）环复制
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一、DNA聚合酶 共同特点： •需要提供合成模板 •不能起始新的DNA链，必须要有引物提供3-OH •合成的方向都是5´-3´ •除聚合DNA外还有其它功能
第四节 原核生物复制的酶系统
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第四节 原核生物复制的酶系统
（1）DNA聚合酶 I 的结构
第三节 DNA复制突变型的筛选
根据温度敏感性筛选 同位素标记法筛选 5´-溴尿嘧啶插入法筛选 质粒温度敏感性的筛选 根据抗药性筛选 根据与突变有关的生物学功能筛选 快停突变和慢停突变筛选
第三节 DNA复制突变型的筛选
慢停突变和快停突变示意图
第四节 原核生物复制的酶系统
大肠杆菌三种DNA聚合酶的性质比较
第四节 原核生物复制的酶系统
DNA聚合酶 I 5'-3'外切活性的功能
第四节 原核生物复制的酶系统
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第四节 原核生物复制的酶系统
（3）DNA聚合酶III的结构
DNA聚合酶的结构类似于人的右手，DNA结合 于三个结构域所组成的大沟内； “手掌”结构域具有高度保守的模块，提供催 化活性位点； “手指”结构域将模板正确结合到活性位点； “拇指”具有使DNA链前进的功能 核酸外切活性形成独立的结构域 N结构域延伸至核酸酶结构与中
DNA聚合酶有6个结合位点： •模板结合位点 •引物结合位点 •引物3´-OH结合位点 •底物dNTP结合位点 •5´-3´外切酶结合位点 •3´-5´外切活性校正位点
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物复制的酶系统
（2） DNA聚合酶I的功能
1. 5´-3´聚合功能 2. 3´-5´外切活性 3. 5´-3´外切活性 切口平移 链的置换 模板转换 4. 内切酶活性
真核中有多个复制起点，双向等速复制
第二节 复制的起点、方向和终点
第二节 复制的起点、方向和终点
D环复制：双螺旋的两条链 并不同时进行复制，轻链先 开始复制，稍后重链再开始 复制，当复制沿轻链开始时， 重链上产生了D环，随环形 轻链复制的进行，D环增大， 重链后亦开始复制，最后两 条链完成复制形成两条新的 DNA又螺旋。
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二、DNA连接酶
作用机制：
•E+ATP
E-AMP+ppi
•E.Coli中：E+NAD 酰胺单核苷酸)
E-AMP+NMN(烟
•E-AMP上的AMP转移到DNA的5‘-PO4上使 其活化
•活化的E与相邻的3’-OH作用形成3复制的酶系统
第四章 DNA的复制
第一节 半保留复制的验证
半保留模型（semioconservetive model） 全保留复制模型（conservetive model） 分散模型（dispersive model）
第一节 半保留复制的验证
验证半保留复制的试验
•Meselson-Stahl实验 •Taylar实验 •姐妹染色单体差别染色方法（sister-chromatid defferential staining）
多聚体 F因子滚环复制中解链
58K
T7噬菌体复制中沿着5´-3´解链
第四节 原核生物复制的酶系统
第四节 原核生物的复制
一、复制起始区的结构特点 1. 富含A-T，这可能和双链易于解开起始复制有关 2. 含有多个回文结构（9-14个GATC），8个GATC较
斑色染色体（Harlequin chromosome） •Cairns复制模型-θ型复制
第一节 半保留复制的验证
第一节 半保留复制的验证
第一节 半保留复制的验证
第一节 半保留复制的验证
中国仓鼠的斑色染色体图
第一节 半保留复制的验证
第一节 半保留复制的验证
第二节 复制的起点、方向和终点
E.Coli及噬菌体的解旋酶
结构
功能
Dna B
rep
Pri A （w 蛋白）
Tra Y/I 基因4
330K 六聚体 66 K 单体 82 K 单体
结合与Ori C、Ori λ参与前引发分离双链， 水解ATP，提供能量
ATP依赖性解旋酶，在ΦX174滚环复制 中推进复制叉
ΦX174RF形成中参与前引发体3´-5´移动 取代SSB，识别特意位点
三、单链结合蛋白
双螺旋去稳定蛋白（helix destabilizing protein） 177个aa组成 在E.coli中以四聚体形式存在 分子量为74KDa SSB与DNA结合表现出协同效应
原因: 1、SSB之间可能存在互作 2、DNA链结构的改变
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解旋酶