双向电泳
一、材料
样品：人神经母细胞瘤细胞SK-N-SH
二、试剂
SDS-PAGE所需试剂
1、30％Acry-Bis (w/v)
29.2％Acry 29.2g
0.8％Bis 0.8g
加水至100ml溶解，棕色试剂瓶4℃贮存，PH<7，数月后重配
2、10％的SDS贮液(w/v)
RT保存，因SDS在4℃会析出
3、Tris-HCl buffer
①1.5M的PH8.8的Tris-HCl buffer——分离胶buffer
100ml含Tris 18.171g，加DDW至80ml，用浓HCl调PH8.8，再定容至100ml，4℃保存
②1.0M的PH6.8的Tris buffer——浓缩胶buffer：
50ml 含Tris 6.057g，加DDW至40ml，用浓HCl调PH6.8，再定容至50ml，4℃保存
4、TEMED
以游离碱形式发挥作用，催化AP形成自由基，故PH较低时，聚合反应受抑制，易吸湿，被氧化，从无色变为黄色，故因密闭4℃保存
5、10％AP
1g的AP溶于10ml水中，4℃保存，隔周新鲜配置
6、PH8.3 电泳缓冲液1L，RT保存
终浓度
Tris碱3g 250mM
Gly（25.05）14.4g 250mM
SDS 1g 0.1% (192mM)
加水至1L，可不调PH
7、甘油液4℃31ml
丙三醇 5.5ml
DDW 25.5ml
8、考马斯亮蓝染液CBB （RT，50%甲醇+冰醋酸+R250）
总体积100ml 终浓度
甲醇Methanal 45ml 45%
水45ml
冰醋酸10ml 10%
R250 0.25g 0.1%
改进：（0.12% G250, 10% (NH4)2SO4, 10% H3PO4, 20% 甲醇）
100ml H2O+100ml H3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状(NH4)2SO4（边搅拌边加）先溶解，然后加入1.2g G250再溶解（不能真正溶解），定容至800ml，边搅拌边加200ml甲醇，终体积1000ml（可至少保存半年）。
9、脱色液
7.5ml的冰醋酸
5ml的甲醇
加水至100ml
或者用含有少量NaCl的清水进行脱色
IEF 试剂
10、一向裂解液Lysis buffer ，-80℃贮存
总体积MW 10ml 终浓度
urea 60.06 4.2042g 7M 硫脲(thiourea) 76.12 1.5224g 2M CHAPS 614.89 0.4g 4%
DTT 154.25 0.108 70mM Amphylyte PH3~9.5 200μl
Tris-base 121.14 0.048456g 40mM
临用前加EGTA (100mM) 400μl 4mM PMSF(100mM) 200μl 2mM
11、一向管胶覆盖液Overlay buffer ，-80℃贮存
Lysis buffer 稀释一倍即可
12、上下槽电泳液（现配）
上槽阴极液（20mM的NaOH）：10ml 1M的贮液加水至500ml 下槽阳极液（10mM的H3PO4）：5ml 1M的贮液加水至500ml 注：若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换
13、平衡缓冲液：一向管胶之后的balance buffer
2% SDS
10%甘油
5%β-巯基乙醇/DTT
62.5mM的Tris-HCl (PH6.8)
微量溴酚蓝
100ml 200ml 终浓度SDS 2g 4g 2%
甘油10ml 20ml 10% β-巯基乙醇/DTT 5ml/1.54g 10ml/3.08g 5% Tris-base 0.757125 1.51425 62.5mM
14、固定液
50%的甲醇+10%的乙酸
15、一向管胶配方
14~15cm*4 14~15cm*8 尿素 1.152g 2.304g
DDW 160μl 320μl 10% NP-40 160μl 320μl
30%Acry-Bis 400μl 800μl 甘油液744μl 1488μl
Amphylyte
PH4~6 18μl 36μl PH6~8 18μl 36μl PH3~9.5 36μl 72μl
10%APS 3.2μl 6.4μl
TEMED 0.8μl 1.6μl
16、分离胶40ml 18*16*0.1cm (1块)
胶浓度12.5% 12.8% 13%
DDW 12.4ml 12.13ml 11.87ml 30% Acry-Bis 16.8ml 17.07ml 17.33ml
1.5M PH8.8 Tris 10ml 10ml 10ml
10% SDS 400μl 400μl 400μl 10% AP 400μl 400μl 400μl TEMED 16μl 16μl 16μl
17、5% 浓缩胶 3.2ml 18*1.5*0.1cm (一块)
H2O 1.84ml
30% Acry-Bis 0.536ml
1M PH6.8 Tris 0.8ml
10% SDS 0.032ml
10% AP 24μl
TEMED 4μl
三、实验步骤
蛋白质样品制备
1、收集冻存的细胞至1.5ml以称重的eppendof管中
2、离心1000rpm 5min
3、弃上清，吸干液体后称重，得到细胞样品质量
4、按每μg/3μl的量加入lys液和1/10的ase
5、混匀后冰浴超声40min~50min
6、4℃放置30min~1h使细胞充分裂解，蛋白溶解
7、临上样前0~2℃266g/min 离心30min
8、测蛋白浓度，分装
第一向：等电聚焦电泳（IEF）
1、管胶的配置：按照试剂所示将各成分溶解于5或10ml的玻璃小烧杯中，搅拌至urea
完全溶解，最后加入TEMED＆APS轻轻搅拌混合均匀（注意搅拌温度不能超过脲
的分解温度37℃）。
2、灌胶：将上次做完2D的1st管泡酸。
使用前捞出，自来水/蒸馏水冲洗，80℃烘干
备用（确保管内干燥无水分）。
APS新购一瓶12ml，先分装1ml至离心管中，原瓶
用封口膜封好（体积占总胶体积的2%）。
在玻管14cm处标记，底部用封口膜封住，管子凉后用注射器罐胶，然后用正丁醇封顶，待胶凝。
3、预电泳：配置上下槽电泳缓冲液，上槽20mM的NaOH，下槽10mM的H3PO4，磷
酸先倒入下槽，NaOH待用（若分离碱性蛋白，上下槽电极液互换）。
吸出管中正
丁醇，用DDW洗3次，拆除底部封口膜，用少量磷酸湿润管底以防气泡产生。
将
管安装至电泳槽上，上槽加入10μl覆盖液+NaOH至顶部溢出，NaOH倒入上槽，安装好电泳槽，开始预电泳，200V 15min ，300V 30min ，400V 45min 。
注：管子、平皿做好标记，表明处理组和对照组。
4、IEF电泳：预电泳结束后，将上槽电极缓冲液倒出，吸出管中上部液体，DDW洗3
次，上样：40μl样品+10μl覆盖液+NaOH至溢出，倒回NaOH，安装好电泳槽，
打开电源开始电泳，600V 14~18h ，800V 1~2h ，1000V 30min~1h 。
5、下胶及平衡：等电聚焦结束后，小心取下胶管洗净玻管表面电极液，将胶条从管中
脱出，DDW洗数次后，balance buffer 中平衡2次，10~15min/次（平衡前，也可用
12%的TCA固定胶条30min以上，清洗后平衡）。
第二向：SDS-PAGE
1、凝胶的制备：同SDS-PAGE，不用插Telfon梳子。
2、上样及电泳：同时拆掉二向胶的夹子和底部胶布，用针头小心将平衡后的一向管胶
移至平板上，再转移至二向胶的顶部，用0.5琼脂糖（用PH8.3的电泳缓冲液配置）封好，安装好电泳槽，倒入下槽电泳缓冲液，移至4℃冰箱中，带琼脂糖完全凝固（以防顶部的agorose未凝，buffer将管胶冲出）之后加入上槽电泳buffer，初始电压60V，待溴酚蓝跑出琼脂糖完全进入分离胶之后，将电压升至120V。
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