・实验研究・激素性股骨头坏死病程中股骨头局部V EGF mRNA 表达的变化及意义△樊粤光 徐传毅 何 伟 方 斌 李 雄 刘少军 曾意荣 袁 浩 摘 要 目的:探讨激素性股骨头坏死病程中股骨头局部血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor ,V EGF )mRNA 表达的变化及意义。
方法:新西兰大白兔36只,随机均分成正常对照组和模型组,每组18只。
模型组用内毒素加激素注射造成股骨头坏死。
两组动物分别于造模后6、10、14周各处死6只行股骨头组织学检查和V EGFmR 2NA 原位杂交观察。
结果:光镜观察示模型组股骨头骨小梁变细、空骨陷窝增加,成骨细胞数量减少,这些表现随着时间的推移逐渐加重;软骨下血窦计数减少,各时段均低于正常组,差异有显著性意义(P <0.05,或P <0.01)。
原位杂交显示,模型组兔的股骨头6周时血管周围有V EGFmRNA 阳性表达,10周时血管、成骨细胞的表达逐渐减少,14周时稍有所增加。
结论:股骨头坏死后血管修复能力下降,血管内皮细胞的功能受到破坏影响,增加股骨头局部V EGF 可能有助于股骨头坏死的修复。
关键词 股骨头坏死; 血管内皮生长因子; 原位杂交中图分类号 R681 文献标识码 A 文章编号 1005-8478(2002)08-0784-03Change and Its Signif icance of the Expression of VEGF Messenger RNA of the Femoral H ead in the Steroid 2induced Avascular N ecrosis of Femoral H ead ∥FA N Y ue 2guang ,XU Chuan 2yi ,HE Wei ,et al.The f irst A f f iliated Hospital of Guangz hou U niversity of T raditional Chinese Medicine ,Guangz hou 510405Abstract Objective :To explore the change and its significance of the expression of vascular endothelial growth factor (V EGF )messenger RNA of the femoral head in the steroid 2induced avascular necrosis of femoral head (ANFH ).Method :36New Zealand rabbits were randomly and equally divided into normal control group and model group.18rabbits in model group were injected endotoxin and methylprednisolone.6rabbits were killed at the time of the sixth week ,tenth week ,fourteenth week in each group respectively.Femoral head s pecimens were studied by histological examination and in situ hybridization.Results :By light microscopy ,empty lacunae increased and numbers of osteoblasts and subchondral sinosoids decreased in model group.By in situ hybridization ,expression of V EGF mRNA showed decrease in the osteoblasts and vascular endothelial cells in the femoral head of model group in the sixth week.Expression decased in the tenth week and increased slightly in the fourteenth week.Con 2clusior :The ability of blood vessel reparation dereases during avascular necrosis of the femoral head.Function of endothelial cells suffers the interruption as well.Increasing local V EGF in the femoral head may be beneficial to the reparative process of necrosis of the femoral head.K ey w ords Avascular necrosis of the femoral head ; Vascular endothelial growth factor ; In situ hybridization△广东省自然科学基金项目(990367) 教育部高校骨干教师重点资助项目(200055)作者单位:广州中医药大学第一附属医院髋中心,广州510405作者简介:樊粤光(19542),男,山西籍,教授,主任医师。
研究方向:髋、膝关节疾病。
电话:(020)36591348 在组织的发育、改建和修复的过程中,均有生长因子的参与和作用,特别在骨骼的形成、骨折的愈合与骨骼的改建过程中。
在股骨头坏死修复与重建中,血管与骨的新生是一个病理逆转的关键。
而骨的新生又离不开血管的新生,已知的与血管新生有关的生长因子有碱性成纤维细胞生长因子(bF GF )、转化因子β(TGF -β)、血管内皮生长因子(V EGF )等,其中V EGF 特异作用于内皮细胞,促进其增殖和血管生成,并可增加血管通透性,也可能在骨的形成与改建中发挥重要作用〔1〕。
本研究用原位杂交法,观察激素性股骨头坏死病程中股骨头局部V EGFmRNA 表达的变化及意义,旨在深入探讨股骨头坏死的病理机制。
1 材料与方法1.1 实验材料1.1.1 实验动物健康成年新西兰大白兔36只,雌雄各半,体重(2.0±0.5)kg ,由广东省医学实验动物中心提供。
1.1.2 试剂盒V EGFmRNA 原位杂交检测试剂盒(购自武汉博士德公司),所包含探针序列为:(1)5′———CA GCC TGGG A CCACT TGGCA TGGTG G A GGT A G A GC ———3′;(2)5′———CACA T CTGCA A GTAC GTTCG TTTAA CT 2CAA GCTGC ———3′;(3)5′———A TA TT AACA T CACGT CTTTG TCTCT A 2G A GC A GTTT —3′。
1.1.3 主要药物大肠杆菌内毒素(美国Sigma 公司)甲基强的松龙(比利时法玛西亚普强公司)1.2 实验方法1.2.1 动物的分组及用药将36只兔按性别随机均分为正常对照组和模型组,每组18只。
造模组于兔耳缘静脉注射内毒素50ug/kg ,24h 1次,共2次。
在第2次注射内毒素后随即腹腔注射甲基强的松龙20mg/kg/d ,连续3d ,正常对照组予等量生理盐水注射。
2周后模型成立(多次预实验结果),两组动物分别于用药后6、10、14周各处死6只行相关检查。
1.2.2 观察项目1.2.2.1 组织学检查取出股骨头,用中性甲醛固定,硝酸脱钙,流水冲洗脱酸,系列乙醇脱水,石蜡包埋切片,切片厚为5μm ,HE 染色。
光镜检查骨细胞坏死,骨小梁上、骨髓腔内血管等病理组织学改变。
1.2.2.2 原位杂交每时间点处死动物6只,在无RNA 酶状态下取新鲜股骨头,沿冠状面对半剖开,一半予4%多聚甲醛/0.1MPBS ,含有1‰DEPC 。
10%EDTA 溶液脱钙,石蜡包埋,5μm 厚切片。
杂交时所用的缓冲液均含1‰DEPC 。
切片脱蜡至水,3%双氧水处理,蛋白酶K 消化,预杂交后,加入标记探针,40℃湿盒中杂交过夜。
杂交后梯度SSC 洗涤,封闭,滴加Ⅰ抗、Ⅱ抗,0.5MPBS 洗涤,用AEC 显染,苏木素复染。
封片后显微镜下观察mRNA 表达分布的情况。
以PBS 代替探针作阴性对照。
2 实验结果2.1 股骨头光镜观察2.1.1 正常组骨小梁完整,排列规则,致密饱满,骨小梁中的骨细胞清晰可见,核较大,位于中央,可见散在的空骨陷窝;成骨细胞沿骨小梁分布,可见成串排列;骨髓造血细胞丰富,脂肪细胞相对较少,形态正常。
2.1.2 模型组(1)骨小梁稀疏,变细,甚至有断裂现象,结构紊乱,有碎片出现。
(2)骨小梁中骨细胞固缩、边聚或消失,空骨陷窝明显增多,第6周平均空骨陷窝率即达到46.1%,第14周平均空骨陷窝率达到58.4%。
(3)髓腔内脂肪细胞体积增大,有的融合成泡状,生血细胞数量减少,软骨下血窦计数减少(见表1)。
(4)骨小梁周沿稍可见梭形成骨细胞排列,但数量很少。
(5)上述病理表现随着时间的推移逐渐加重。
表1 软骨下血窦计数(个)( x ±s )组别6周10周16周正常组模型组9±36±2310±26±3310±35±333注:与正常组相比, 3P <0.05; 33P <0.012.2 原位杂交观察(见图1～4)AEC 染色的阳性表达为红色。
正常的股骨头组织高倍镜下,可以看到在骨小梁、髓腔以及软骨下血窦的微小血管内皮细胞的胞浆中有阳性表达。
在活性较高的骨小梁(具体表现为空骨陷窝少)周沿的柱状或立方状的成骨细胞中亦有阳性表达,阴性对照片未出现阳性表达。
在内毒素加激素导致的股骨头坏死模型的股骨头中,6周时血管周围有阳性表达,说明此时血管在破坏情况下,已经有一定的修复反应,但随着时间的推移,10周血管、成骨细胞的表达逐渐减少,14周时稍有所增加。
结果表明,股骨头坏死后血管修复能力下降,血管内皮细胞的功能受到破坏影响。
图1 正常组成骨细胞内V EGF 表达阳性,AEC 染色×400。
图2 模型组成骨细胞内V EGF 表达弱阳性,AEC 染色×400。