显微镜下可发现细胞回缩变圆，细胞间隙增大，此时应立 即终止消化
加入完全培养基5mL，用吸管反复吹打 计数板计数 分瓶培养
细胞的消化传代方法
生长细胞形态
四、作业与思考
1．简述细胞传代培养的操作程序及注意事项。 2．细胞培养获得成功的关键要素是什么? 3．简述体外培养细胞的形态特征及其生长阶段。 4．绘制细胞生长曲线图。 5．绘制细胞分裂指数图。
4、金属器材的清洗处理方法 金属器材的清洗处理方法 纸擦去表面的油脂
洗衣粉煮沸或用1%碳酸氢钠化传代方法
吸除或倒掉旧培养液
加入2mL，无钙、镁PBS，漂洗一次后倒掉 加入1mL消化液（0.25%胰蛋白酶或0.02%EDTA或混合液）
肉眼可观察到“薄膜”现象时，倒掉消化液 继续作用2～3分钟
分别在5min、15min、20min观察细胞融合
细胞融合
2、PCC诱导和观察
90分钟后离心弃上清 加入0.075mol/lKCl8ml
混匀37℃25分钟 加入1ml固定液混匀离心弃上清
加7ml固定液固定20min 离心弃上清加0.5ml固定液 滴片（冰、高、烤）Giemsa染色12min
水冲、晾干、镜检
细胞工程实验
新乡医学院生命科学实验教学中心
课程组成员：杨慈清 、李虎、王红霞、许重洁
办公电话：3029114
目录
实验一 动物细胞的培养 实验二 细胞融合技术与染色体提前凝集标本制 备实验三 小鼠MEF饲养层的制备 实验四 MS培养基的配制和愈伤组织诱导 实验五 原生质体的分离、纯化和活力鉴定
实验一 动物细胞的培养
显微镜下的培养细胞
三、实验方法
方法
1、玻璃器材的清洗处理方法 2、塑料器材的清洗处理方法 3、橡皮器材的清洗处理方法 4、金属器材的清洗处理方法 5、细胞的消化传代方法
1、玻璃器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗
清洁液浸泡或用2%磷酸三钠或洁消精浸泡过夜
自来水冲10次
单蒸水洗2次
晾干备用
培养瓶再用三蒸水浸泡过夜
晾干
包装
灭菌 备用
2、塑料器材的清洗处理方法
浸泡
刷洗 用3%HCl或2%NaOH溶液浸泡过夜
（单用或交叉处理） 水洗10次 单蒸水2次
三蒸水浸泡过夜 晾干
紫外线或辐射灭菌备用
3、橡皮器材的清洗处理方法
浸泡 刷洗
5%NaOH煮10 ′ ～20′ 水洗
4%盐酸煮10 ′ ～20′ 水洗8~10次
单蒸水洗三次、二蒸水洗一次晾干备用
将原代培养的MEF细胞进行传代，多为3－ 6代，这样不仅可以使得MEF细胞的纯度较 高，而且生长状态也很好。在制备饲养层 前将MEF细胞用丝裂霉素C或射线照射预处 理，抑制DNA的复制使其在保持分泌功能 的基础上失去增值能力，以免与ES的生长 发生竞争。
在具体实验中，MEF细胞的原代分离时胎龄的选择，作 为饲养层使用时细胞代数的选择，丝裂霉素处理的浓度 都会影响饲养层培养体系的质量。
三、实验方法
1、细胞融合方法 2、PCC诱导和观察
1、细胞融合方法
收集1瓶M期细胞、消化一瓶贴壁细胞混合离 心用Hank’s液洗1次
离心弃上清（吸干）轻弹使细胞分散
37℃滴加50％PEG0.5ml（12滴）
90s后
加入5ml1640洗一次（不要吹打）离心 加入2ml 1640（含10％血清） 加一滴秋水仙素（10μg／ml ）
一、实验目的
1. 掌握干热灭菌法、湿热灭菌法和滤过 除菌法的操作。
2. 了解化学消毒法的使用方法。 3. 了解传代细胞的传代方法及操作过程，
学习观察体外培养细胞的形态及生长 状况及细胞增殖动力学测定的方法。
二、实验原理
细胞培养是一种操作繁琐而又要求十分严 谨的实验技术。要使细胞能在体外长期生长， 必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所 必需的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、 维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、氧气、 适宜的温度，注意外环境酸碱度和渗透压的调 节。二是严格控制无菌条件。
胎龄过大，则成纤维细胞的成分降低，分离效率低下， 且易混杂其他细胞，难以去处。若胎龄过小，胚胎形态 小，躯干部分不易分辩，操作困难。
细胞代数过多，则出现衰老征象；细胞代数过少，不容 易纯化。
丝裂霉素的浓度处理和处理时间直接影响细胞的状态。
二、实验方法与步骤
1.MEF的获取：
（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵 （2）2：1合笼过夜 （3）取出有阴道栓的开始记时间为0.5天 （4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料 （5）无菌 取出胚胎 （6）去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部 （7）用眼科剪刀剪成1mm3组织块 （8）0.25%胰蛋白酶消化20min/室温，每隔5min振荡 一次 （ 9）过滤（200目筛网）并收集滤液（含有单个的MEF）
实验二 细胞融合技术与染色体 提前凝集标本制备
一、实验目的
通过细胞融合技术，初步了解染色体 提前凝集标本制备原理、方法及间期细胞 三种时相的提前凝集染色体特点。
二、实验原理
M期细胞内有某种促进染色体凝集因子，它无 种属特异性，所以在细胞融合和染色体技术的基 础上，建立了制备染色体提前凝集标本的方法。 即让M期细胞与间期（I期）细胞融合，从而诱导I 期细胞染色质提前浓缩成染色体。形成的这种染 色 体 称 提 前 凝 集 的 染 色 体 (Prematurely Condensed Chromosome，PCC)。
四、作业与思考
1. 根据PCC图像的观察，试说明对于理 解细胞周期和DNA复制有什么启示?
2. 简述细胞融合的原理。 3. PCC实验的主要意义是什么？
实验三 小鼠MEF饲养层的制备
一、实验目的
1.掌握常用饲养层的制备原理和方法。 2.巩固细胞培养相关的的技术。
二、实验原理
胚胎干细胞（embryonic stem cells,ES）的体外培养要 求增殖的同时保持未分化的状态，因此，我们要进行体外 培养胚胎干细胞，必须环境中满足两个条件：细胞生长因 子和分化抑制因子。体外培养的成纤维细胞可以分泌细胞 生长因子和分化抑制因子，前者可以促进ES细胞的增值， 后者可以有效的抑制ES的自主分化。目前，可以用来制作 饲养层的细胞有多种，其中原代小鼠胚胎成纤维细胞 （mouse embryonic fibroblast, MEF）取材方便，易于铺层， 分泌能力强而成为ES细胞首选的饲养层细胞。