信阳师范学院大学生科研项目申请书项目类别（在相应序号上划O1. 人文社会科学研究项目②.自然科学研究项目所属学科：自然科学淮南麻鸭PPAR和ANGPTL基因课题名称：编码区序列突变检测研究申请者：张晓婷所学专业：生物科学系（院）名称：生命科学申请日期：2009-10-10信阳师范学院制论证报告一、本课题的研究现状及意义淮南麻鸭是我国优良的地方家禽品种。

主产于河南省信阳市光山、商城、罗山、平桥、固始、新县等县区，1980年经河南省地方优良畜禽品种编委会正式命名为淮南麻鸭。

淮南麻鸭体型中等，具有蛋肉兼用，喜水耐旱，适应性、抗逆性强，耐粗饲，易养，生长快，觅食力强，产蛋较多，肉质肉味好等特点，已被列入《河南省地方优良畜禽品种志》，是河南省重点保护的优良地方品种之一。

虽然淮南麻鸭有许多优良特点，但其生长速度、育肥性能与大型蛋肉兼用鸭如北京鸭还有相当差距［1］，专门化肉用性能不能突出。

而且由于多年来缺乏系统的选育，加上主产区引入多个肉鸭品种，造成淮南麻鸭品种混杂、退化，其体型、外貌不一致，群体整齐度差，生产性能下降，品种内个体间的生产性能差异显著，严重制约了该品种的饲养和推广［2-3］，作为一个地方品种，已经不能满足人们对肉类的高质量的需求，如不进行品种改良，将会在激烈的市场竞争中被淘汰出局。

为加快淮南麻鸭的产业化开发进程、提高产肉性能，就必须对其进行遗传改良。

分子育种技术从一诞生就受到科学家的极大关注，现已在畜牧业发展过程中收到了良好的效果［4］。

目前淮南麻鸭的育种方法主要是常规的杂交育种，世代周期长，效率较低，而分子育种可明显弥补这一不足，有效加速育种进程。

利用现代生物技术手段，从分子水平对麻鸭品种资源进行检测和遗传多样性研究、促进遗传资源保护已成为麻鸭育种的必然趋势。

目前,国内用分子手段研究淮南麻鸭的很少,李慧芳、杨宁、张汤杰等用分子标记技术研究了国内包括淮南麻鸭在内多个地方鸭种的遗传多样性［5-8］，但对淮南麻鸭的系统研究很少,且不够深入全面,对淮南麻鸭进行功能基因检测的研究未见报道，因此对淮南麻鸭的遗传改良进行更深入的研究是十分必要的。

近年来，随着人们消费水平的提高，改善肉质成为当前畜禽行业面临的主要问题之一。

沉积在肌肉内的脂肪是影响肉质和风味的一项重要经济性状。

对于家禽而言，研究脂肪性状是家禽育种工作的一个重要方面，从DNA 水平上研究肉质已经成为一个研究热点［9］。

过氧化物酶体增殖物激活受体（PPAR）基因能够调控许多参与细胞内外脂类代谢的目的基因，也能够参与脂肪细胞的分化。

PPAR基因在不同物种中存在几种亚型，包括种a丫3种亚型和3亚型，几种亚型在不同组织中的表达量有较大差异。

对脂肪代谢有影响的主要是PPAR—o和PPAR- Y用PPAR基因作为家禽脂肪性状的候选基因的研究近几年来逐渐展开。

孟和等（2002）以PPAR- a作为影响鸡脂肪性状候选基因的研究结果发现，在编码区大约1.2kb处存在1个C-T突变，导致了脯氨酸（Thr）变为异亮氨酸（lie），产生了3种基因型，BB基因型与AB和AA基因型相比有较高的腹脂重和腹脂率，推测PPAR- o基因可能是影响鸡脂肪代谢的主效基因或与控制该性状的主效基因紧密连锁，并能用于对脂肪性状进行分子标记辅助选择［10］。

李春雨等（2004）以鸡的PPAR-谨因作为候选基因进行研究，在编码区发现了C292T突变，表现出3种基因型，在7周龄的腹脂重和腹脂率差异显著[11]。

孟和等(2004)经Northern杂交法研究结果表明，PPAR-谨因在脂肪和肾脏中高量表达[12]。

ANGPTL4 基因( angiopoietin-like 4 gene ，类血管生成素4基因)具有酶抑制剂活性，可以负调控脂蛋白脂酶活性，正性调控脂类代谢，促进脂肪动员，抑制脂肪贮存等作用[13-15]。

ANGPTL4基因是过氧化物增殖体激活受体PPAR- 丫的靶基因，而PPAR- 丫主要参与脂肪形成，因此推测ANGPTL4 基因可能与鸭脂肪含量有一定关系。

综上所述，本研究以PPAR和ANGPTL4基因为侯选基因，以淮南麻鸭为材料，运用PCR-SSCP、PCR-RFLP和DNA测序技术对所选基因的编码区进行突变检测，旨在为淮南麻鸭的合理开发利用和肉用性能改良提供参考依据。

参考文献[1] 张斌,胡建新，林琳,赵倩•淮南麻鸭品种资源调查与思考[J].中国畜禽种业，2007,7 : 46-48.[2] 赵云焕，赵聘.淮南麻鸭本品种选育方案J].水禽世界，2007,4: 46-47.[3] 赵云焕,刘纪成,赵聘,程丰.淮南麻鸭产业化开发研究[J]. 信阳农业高等专科学校学报,2006,16(3):111-113.[4] 林金杏，曹学亮.家禽分子育种现状及其发展趋势J].中国家禽.2008,30(5)48.[5] 李慧芳.中国地方家鸭品种的分子遗传多样性研究[D]. 扬州大学博士研究生学位论文:扬州，2008.57-85.[6] 张汤杰. 江淮流域家鸭遗传多样性及高邮鸭产蛋性状的研究[D]. 扬州大学博士研究生学位论文:扬州，2007.39-98.[7] 李慧芳，杨宁，马月辉，等冲国蛋鸭品种资源的遗传变异J].山东农业大学学报，2006, 37( 4): 536-540.[8] 李慧芳，李碧春，杨宁，等.华中地区家鸭种质资源的遗传结构研究J].畜牧兽医学报,2008,39(3):291-295.[9] 张红,龚道清，张军.家禽脂肪性状相关基因研究进展[J].中国畜牧兽医.2007,34(4):52-57.[10] 孟和,王桂华，王启贵,赵建国，顾志良,王宇祥,李辉.鸡PPAR基因单核苷酸多态与脂肪性状相关的研究[J].遗传学报，2002,29⑵：11》123,[11] 孟和，李辉,王宇祥.鸡PPARs基因组织表达特性的研究[J].遗传学报,2004,31 (7): 682-687.[12] 李春雨，李辉. 低脂肪肉鸡遗传选择方法及效果研究进展[J]. 中国家禽,2004,26(14):35-38.[13] 马云.牛三个基因的分离、定位及其与牛经济性状的关联研究[D] 西北农林科技大学博士研究生学位论文:陕西杨凌，2006.[14] 马云,李芬，王启钊，等.南阳牛血液基因组DNA提取与ANGPTL4基因的PCR扩增[J].新乡学院学报.2009,26(2): 48-51.[15] 崔宏，赵国强.ANGPTL4的研究进展[J].中国实用神经疾病杂志.2008,11 ( 11): 56-58.、本课题的研究内容、特色和创新之处，预计突破哪些难题1. 本课题的研究内容以随机抽取的淮南麻鸭为材料，采集血样，提取基因组DNA以Gen Ba nk公布的人(或者鸡)的PPAR基因序列作为参照序列，设计PCR引物，用同源序列克隆法克隆鸭ANGPTL4基因并设计引物，采用PCR-SSCP PCR-RFLP吉合DNA测序技术，对该基因编码区序列的突变进行检测。

2. 本课题的研究特色和创新点首次利用淮南麻鸭对影响肉质性状的重要功能候选基因PPARANGPTL的编码区序列进行突变检测，首次利用同源序列克隆法克隆鸭的ANGPTL4基因。

研究结果对于我国地方鸭种资源的肉用性能改良具有较重要的参考价值。

3. 本课题拟解决的关键问题SSCP分型、酶切位点的准确导入、以及测序图的准确解读是本实验的难点，也是本实验拟解决的关键问题。

三、本课题的研究方法、步骤、可行性论证，研究工作总体安排及进度和预期成果1. 本课题的研究方法采集血样，提取基因组DNA设计合成引物，PCR扩增并检测产物，琼脂糖凝胶电泳检测，确定为阳性后在变性的聚丙烯酰胺凝胶上电泳，SSCP分析,最后进行统计分析。

2. 本课题的研究步骤(1)血样采集与保存翅静脉采集血样，EDTA抗凝，低温贮存带回实验室，-20C保存。

(2)全血基因组DNA的提取与检测参照李慧芳［10］的方法并作适当改动。

(3)引物设计以GenBank公布的PPAR和ANGPTL4i因序列为参照序列，设计引物，利用同源序列克隆法克隆鸭的相应基因并设计检测突变的PCR扩增引物。

(4)PCR扩增及产物检测常规PCR扩增，琼脂糖凝胶电泳抽检扩增产物。

(5)PCR产物SSCP分析聚丙烯酰胺凝胶电泳分离扩增产物，银染法检测电泳结果。

(6)PCR产物的序列测定与比对分析本研究的技术路线图如下所示：3. 可行性论证（1）理论可行性①淮南麻鸭主产于信阳的光山、 商城、罗山、平桥、固始等县区 , 我校距离淮南麻鸭的主 产地很近，取材及调研都十分方便。

另外 , 到目前为止，国内所做的关于淮南麻鸭的研究很 少，远远不能满足淮南麻鸭的发展需要。

因此，我们所要做的研究是十分必要的。

②自微卫 星技术被发现以来， 很多研究者用微卫星标记对家禽如鹅、 鸡以及其它鸭种的遗传多样性进 行了分析，该技术的理论已基本成熟。

（2）技术可行性①项目组成员都曾帮助我校 05 级毕业生完成毕业论文试验，具有一定的分子基础和试 验操作能力。

②本研究的指导老师知识渊博， 且责任心强， 曾经发表过多篇分子水平的高水 准论文 , 在他们的精心指导下 , 我们一定能够顺利实现研究目标。

③除此之外， 本研究将会在 生科院分子生物学实验室和细胞实验室进行， 实验室长期承担了信阳牛及南阳黄牛的遗传育 种, 实验人员在牛等其它动物上做了大量的工作，已经掌握了娴熟的技术。

另外，实验室已 经具备了本研究所需实验仪器设备条件，这为本项研究的顺利开展提供了有利的物质保障。

唯一所缺的实验材料——淮南麻鸭血样，将会在项目得到批准后取得。

4. 研究工作总体安排及进度2009.12.07-2010.01.08 PCR 条件优化 2010.01.09-2010.01.31 PCR 产物的检测2010.02.01-2010.02.28 序列比对，统计分析，撰写论文 2010.03.01-2010.03.20 项目总结5. 本课题的预期成果检测出ANGPTL 破PPAR 基因编码区的突变，并发表学术论文1-2篇。

四、研究工作的资料、设备等准备情况申请者及项目组成员在前期准备工作中，差得有关研究资料意义等等。

本研究的实验室工作在信阳师范学院生命科学学院分子生物学实验室进行。

试验室现有的仪器和设备：PCR 热循环仪（型号： Gene Amp PCR System96O0 ,电泳仪（型号：DYY-6C型） ,水平电泳槽（型号： DYCP-31B ）,高速冷冻离心机（型号： Mini Spin ） ,凝胶成像系统型号： UVPGDS-8000）, 移液枪 （型号 Finnpipette ） 等 , 硬件条件完全可以满足该项目研究的分析与检测要求。