基因工程制药姓名：惠霞学号：2011506024班级：2011级生技1班基因工程制药一．基因工程制药常用的工具酶：基因工程的重要特点之—是在体外实行DNA分子的切割和重新连接。

例如要取得所需药物之目的基因并要将此特定目的基因与载体DNA连接在—起，在很大程度上要依赖于某些工具酶。

(一) 限制酶(Restriction enzymes)限制酶即限制性核酸切酶的简称，是一类专一性很强的核酸切酶。

与一般的DNA水解酶不同之处在于它们对碱基作用的专一性上及对磷酸二酯键的断裂方式上具有一些特殊的性质。

限制酶的种类Ⅰ型酶：早期提取的酶类，是一类复杂的多功能酶，在基因工程上的应用价值不大。

Ⅱ型酶：相对分子质量较小，为20000～100000，是简单的单功能酶，作用时无需辅助因子或只需Mg2＋。

能识别双链DNA上特异的核苷酸序列，底物作用的专一性强，而且其识别序列与切断序列相一致。

这类酶对基因工程中的生化操作特别重要。

(二) DNA聚合酶(DNA polymerase)DNA聚合酶是能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤的一类酶，这类酶作用时大多数需要DNA模板并且优先作用于DNA模板，也可作用于RNA模板，但效率较低。

1．大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ2. 大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ大片断Klenow 片断3. T4噬菌体DNA聚合酶4. 经修饰的T7噬菌体DNA聚合酶（测序酶）5. T aqDNA聚合酶及AmpiTaqTMDNA聚合酶6. 反转录酶（三）DNA连接酶（DNA ligase）：能将两段DNA拼接起来的酶。

1. T4噬菌体DNA连接酶：催化DNA的5'羟基之间形成磷酸二酯键。

2. 大肠杆菌DNA连接酶：用途较窄，不常用。

（四）基因工程中常用的其他酶1. 末端脱氧核苷酸转移酶（末端转移酶或TDT酶）2. T4噬菌体多核苷酸酶3. 核酸酶（Nuclease）4. 碱性磷酸酯酶（Alkaline phosphodiesterase）：能催化去除单链或双链DNA和RNA 分子中的5' 磷酸基（脱磷酸作用）。

分为细菌碱性磷酸酯酶（BAP），牛小肠碱性磷酸酯酶（CIP）。

二．基因工程制药中常用的克隆载体载体：能在细胞进行自我复制的DNA分子就是外源DNA片段（基因）的运载体（Vector）,又可称为分子载体或无性繁殖载体。

基因工程制药中常用的目的基因克隆载体主要有：质粒、λ噬菌体、M13噬菌体和粘粒。

（一）质粒1.质粒（Plasmid）是一些存在于微生物细胞染色体外的闭合环状双链的小型DNA分子，是能进行独立复制并保持恒定遗传的辅助性遗传单位。

2 常用的几种质粒载体（1）pBR322及其衍生载体pBR322 最早构建成功的较理想载体，分子质量2.6×106u，4.36kb，属松弛型复制，含有两个抗性基因（Tetr和Ampr），已确定32个限制酶切割位点的相对位置。

BamH I等10个切点位于Tetr基因，Pst I 等6个切点位于Ampr基因组，EcoR I位点位于这两个基因之间，有利于检出重组转化子。

PAT153载体：用限制酶Hae Ⅱ进行部分消化pBR322后再重新连接而获得，是不能被带动的较小质粒载体（3.66kb），拷贝数比pBR322增加1.5～3倍。

pBR327载体：用EcoR Ⅱ部分酶切pBR322，去除非必需区段（位点1442~2502）后构建而成。

长仅3.27kb；没有泳动功能；质粒拷贝数增加2～4倍。

(2) pUC系列载体ⅠpUC18、pUC19质粒载体含有pBR322的Ampr基因、复制原Ori和M13噬菌体M13mp系列载体所用的LacZ基因，在Lac区有独特的限制酶识别位点组成的多聚接头顺序（即多克隆位点），这两个载体不同之处在于多克隆位点以互为相反的方向排列。

pUC质粒缺乏与控制拷贝数有关的mop基因，故这些质粒复制的拷贝数要比带有pMB1(或ColE1)复制起点的质粒高的多。

pUC18/19载体能表达LacZ基因产物（β－半乳糖苷酶）的氨基端片段，在相应的宿主（Lac-）中可出现α互补。

ⅡpUC118、pUC119质粒载体ⅢpUC的衍生质粒载体：pSP64、pSP65、pGEM-3Z、pGEM-3Zf(-)、pGEM-4、pGEM-4Z 等。

（二）λ噬菌体1 常用的λ噬菌体载体（1）Charon系列载体为克隆DNA大片段而设计的替换型载体。

代表性载体有：Charon4A、pCharon21A(早期)、Charon32～35和Charon40等。

（2）EMBL系列载体克隆大片段基因组DNA的替换型载体。

最常用的是EMBL3、EMBL4和EMBL3A，这些载体多克隆位点上的BamH I位点两侧分别有EcoR I和Sal I位点，EMBL3和EMBL3A含有对称的两个多酶位点聚合接头序列（Sal I-BamH I-EcoR I），以便于Sal I、Xho I（都是↓TGGA）、BamH I、MboＩ、Bgl Ⅱ、Xho I (都是↓GATC)和EcoR I等7种限制酶切点外源DNA片段的克隆。

EMBL4的多聚接头区的限制性切酶位点顺序刚好与EMBL3颠倒。

（3）λgt系列载体插入型系列载体，包括λgt10、pλgt11和λgt18～23等系列载体。

λgt载体是专门为在其免疫区（imm434）单一的EcoR I位点上克隆小的cDNA片段（约6kb）而设计的。

λgt10为43.3kb，在它的阻遏基因CI中有唯一的EcoR I位点，外源cDNA 片段（<7.6kb）插入此处时，使CI基因失活，形成了重组的CI－噬菌体，噬菌斑为清亮斑，可与非重组的CI－噬菌斑所产生的阴暗噬菌斑相区别。

λgt11载体是一个常用的，可用于免疫学筛选的载体。

具有可表达性，为43.7kb，在它的LacZ基因末端（位于终止密码上游53bp处），有唯一的EcoR I 位点，可用于插入外源DNA片段。

λgt18、λgt19是λgt的衍生载体，其LacZ的EcoR I位点插入了一个含Sal I、Sac I、Xba I和EcoR I位点的多克隆位点，但只有EcoR I和Sal I是单一酶切点，cDNA片段可插入LacZ单一的EcoR I或Sal I位点。

（三）M13噬菌体1 M13噬菌体的基本特性M13噬菌体的基因组为环状单链DNA分子，由6407个核苷酸组成，有8个基因。

M13是雄性专一性的，即只吸附于带有F质粒的雄性大肠杆菌（F＋）的性纤毛上而引起感染的。

受M13感染的细胞不被裂解破坏，在平板上不形成空斑而是形成缓慢生长的慢性感染细胞圈。

2 常用的M13噬菌体载体M13mp18和M13mp19，这两个载体在LacZ区的多克隆位点中都含有13个不同的酶切位点（只是在多克隆位点的方向上有所不同），可供插入由多种各不相同的限制酶切割而成的DNA片段。

（四）粘粒（Cosmid）1 粘粒：是一种有λ噬菌体粘性末端的杂种质粒，由λDNAcos区与质粒DNA重组构建而成。

它是为克隆和增殖基因组DNA的大区段而设计的，是组建真核生物基因文库及从多种生物中分离基因的有效手段。

粘粒大小一般为4~7kb。

最简单的粘粒是一些经过改造的质粒，它们带有一个拷贝的cosDNA序列（将DNA包装的λ噬菌体颗粒中所必需的序列），携有一个复制起点（通常是ColE1复制起点）和一个抗药性标记（通常是Ampr）（五）哺乳动物细胞载体系统（用于转染哺乳动物细胞的载体，有两类）不带真核复制子的质粒型载体：在原核质粒中插入一个完整的哺乳动物细胞转录单位和一个选择标记基因而组成的简单载体系统。

这类载体在转染哺乳动物培养细胞之前要在细菌中进行扩增，而在转染后则整合到细胞基因组中并在基因组调控下低水平地表达相应的蛋白质。

如pTK2、、pHyg和pRSVneo等。

带有真核病毒调控序列元件的质粒表达载体。

如：SV40载体、牛乳头瘤病毒（BPV）载体和人类疱疹病毒（EBV）载体。

三．连接方法1、粘性末端DNA片段的连接:DNA分子的体外连接（重组）是指外源DNA片段和载体DNA分子在体外通过DNA连接酶共价连接。

具有粘性末端DNA片段的连接比较容易，也比较常用。

选用一种对载体DNA 只具唯一限制点的限制酶，进行位点特异的切割，形成全长的具粘性末端的线性DNA分子。

再将外源DNA大片段也用同种限制酶切割，产生同样的粘性末端。

最后用T4噬菌体DNA 连接酶能很容易地将载体与外源目的基因连接起来。

2、平头末端DNA片段的连接:平头末端DNA片段的连接除了直接用T4连接酶连接外，还可以先用末端核苷酸转移酶给平头末端DNA分子加上同聚物尾巴之后，再用DNA连接酶进行连接。

现在常用的平头末端DNA片段连接法有同聚物加尾法、衔接物连接法及接头连接法。

同聚物加尾法：同聚物加尾是指在相互连接的两类DNA分子中，其中一类的3'末端加上一段聚脱氧腺苷（polyA），另一类的3'末端加上一段聚脱氧胸苷（polyT），然后二者混合，在T4DNA连接酶作用下连接成环状分子。

衔接物连接法：衔接物是指用化学方法合成的一段由10~12个核苷酸组成、具有一个或数个限制酶识别位点的平头末端的双链寡聚核苷酸片段。

将衔接物的5'末段和待克隆的DNA 片段的5'末端用多核苷酸激酶处理使之磷酸化，然后通过T4 DNA连接酶使两者连接起来。

接着用适当的限制酶消化具有衔接物的DNA分子和克隆载体分子，结果使二者都产生出了彼此互补的粘性末端。

随后按常规的粘性末端连接法，将待克隆的DNA片段同载体分子连接起来。

3.人工接头连接法：人工接头是指人工合成的含有限制酶识别顺序的核苷酸片段。

将具有平头末端的外源DNA 片段与人工接头分子在T4 DNA连接酶的作用下连接起来。

再用限制酶切割产生具有粘性末端的DNA片段，然后与具有同样粘性末端的载体DNA分子在T4 DNA连接酶作用下连接成重组体。

四．目的基因的获取目的基因的获取方法有三种：1、从基因文库中获取需要构建基因文库，构建的方法：（1）构建基因组文库：直接分离法（2）构建部分基因文库如cDNA文库：逆转录法2、PCR扩增是针对目的基因序列未知的情况，可采用PCR扩增。

3、人工合成其实有两种：（1）逆转录法；（2）化学方法人工合成；针对目的基因序列已知且较小的情况。

五．转化方法⑴、微生物：感受态细胞法①、感受态细胞：指细菌细胞经过Ca2 处理后，细胞壁透性增强，能够吸收周围环境中DNA分子的生理状态。

②、过程：Ca2 处理细胞→感受态细胞→表达载体与感受态细胞混合→感受态细胞吸收DNA分子。

⑵、植物细胞：农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法①、农杆菌：土壤微生物，易感染双子叶植物和裸子植物；对大多数单子叶植物没有感染力。