g e n e
D o th e s e p ro te in s b in d ?
Y
X
X
X Y
o u r t w o h y b r i d p r o t e i n s b i n d !
yes, we have expression of the reporter indicating that the proteins bind!
Y
t h u s f o r m i n g a f u n c t i o n a l t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r . . . X
Y
do we get expression of the reporter?
r e p o r t e r g e n e
阳性克隆的筛选：
将在SD/-Trp培养基上长出的酵母菌落转移到SD/-His培 养基上进行筛选。30℃培养2天，检查生长情况。 对生长状态较好的单克隆进行β-半乳糖苷酶活性分析。
β-半乳糖苷酶活性分析（酵母克隆滤纸显色分析）
1. 取2ml的Z缓冲液/X- gal溶液润透2张滤纸；
2. 小心取一张滤纸覆盖于生长有转化子的平皿上，用涂布棒小心赶出气 泡，使滤纸尽可能与酵母菌接触（1min）；
自激活原理
GAL4BD Transcription factors
X
X
r e p o r t e r g e n e
His, β-gal
YPDA培养基
YPDA 蛋白胨 酵母提取物 琼脂 0.2%ade 葡萄糖 液体 500ml 10g 5g —— 10ml 10g 固体 100ml 2g 1g 2g 2ml 2g
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
g e n e
Yeast two-hybrid system:
GAL4分子的BD可以同上游激活序列 (upstream activating sequence,UAS)结合。 AD则能激活UAS下游的基因进行转录。 单独的BD和AD都不能激活UAS的下游 基因，它们之间只有通过某种方式结合 在一起才具有完整的转录激活功能。
Yeast two-hybrid system:
Yeast two-hybrid system:
a genetic assay for detecting protein-protein interactions Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
His, β-gal
一般情况下，单独的 BD 可以与 GAL4 上游活化序列（ GAL UAS ）结合，但不能 引起转录。然而，将一段具有转录激活活性 的转录因子基因构建到 BD 载体上，若其表 达产生的 BD 单独与 UAS 结合也可以引起 下游报告基因的转录，那么就称之为酵母双 杂中的自激活现象。反过来，可以利用这种 自激活现象来验证某个转录因子是否具有转 录激活活性。
上，即成为酵母感受态细胞。
（只能现做现用，不能贮存，室温只能放置1-2hr）。
酵母转化
1. 鲑鱼精 DNA（20μg/μl）沸水中煮20min，冰上冷却10min。 2. 加入100μl酵母感受态细胞、1~2μl构建质粒（约200ng）、100μg鲑 鱼精、600μl TE-LiAc-PEG，变速涡旋10s~1min至混匀。 3. 30℃，200rpm/min，恒温摇床振荡30min。 4. 加入70μl DMSO，温和颠倒混匀。 5. 42℃水浴热休克15min，后冰浴10min。 6. 常温下，3000rpm离心10s；弃上清（去干净），用0.5ml 1×TE重悬 细胞。（ 1×TE室温只能放置1~2hr） 7. 将转化后的酵母培养于SD/-Trp培养基上，30℃倒置培养约3-5天，直 至出现菌落。
0.2g ade定容至 100ml → 0.2%的ade母液
pH 6.5
灭菌 121℃ 15min
正对照：pGAL4
负对照： pBD-GAL4
酵母菌株感受态细胞制备：
1. 将-70℃下冻存的酵母菌在YPAD平板上划线，倒置于30℃培养2-3天。 2. 挑取2-4个大菌落（直径2-3mm）于1.5ml YPAD液体培养基中，剧烈震 荡5min，打散菌落，接种于50ml YPAD液体培养基中（250ml三角 瓶），230-250转/min，30℃培养18-24hr。 3. 取菌液测定其OD600值，需达到1.5。若不到，再培养1~2hr，若还不到， 换单克隆重摇。 4. 取50ml菌液于300mlYPAD培养基中（1-2L大三角瓶），30℃， 230rpm，摇培3hr，至 OD600值为0.4~0.6。 5. 4000rpm 5min 于常温收集菌体，重复一次。 6. 室温下1000g离心5min，去上清，加入50ml 超纯水清洗悬浮3次。 7. 1000g离心5min，弃上清，用新配的1.5ml 1×TE/LiAc重悬细胞，置冰
a genetic assay for detecting protein-protein interactions
Regulation of gene expression in yeast
t r a n s c r i p t i o n a c t i v a t o r
a c t i v a t i o n d o m a i n
酵母双杂交自激活 现象
一、原理
真核生物的转录因子是由两个可以分开的、 功能上相互独立的结构域(domain)组成的。
酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个 由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113个 氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。
a c t i v a t i o n d o m a i n
D N A b i n d i n g d o m a i n
U A S ( u p s t r e a m a c t i v a t i o n s e q u e n c e )
t r a n s c r i p t i o n m a c h i n e r y
3. 用一根针在滤纸上刺个小孔以标记菌落位置，用镊子轻轻取出滤纸， 沾有菌的面朝上置液氮中10s，夹出滤纸，室温解冻；重复3次； 4. 沾有菌的面朝上，紧贴于预先用Z缓冲液/X-gal溶液润透过的那张滤纸 上，同时吸掉多余的Z缓冲液/X-gal溶液； 5. 沾有菌的面朝上，纸间不要有气泡，放置于30℃温箱3-8h，观察酵母 的颜色变化。
a genetic assay for detecting protein-protein interac.
X
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and the question, do these two protein bind each other?
One way of answering this question is to use the yeast two hybrid method.