COOCH2 NHCH2OH
HCHO
COOCH2 NH(CH2OH)2
试剂器材
试剂
1. 10～40g/L酪蛋白溶液（pH8.5）： 四种不同［S］的酪蛋白标准溶液。 2. 中性甲醛溶液：75mL分析纯甲 醛加15mL 0.25%酚酞乙醇溶液， 以0.1M NaOH滴至微红，密闭于 玻璃瓶中。（自己配制） 3. 0.25%酚酞乙醇溶液： 4. 标准0.1M NaOH溶液。 5.胰蛋白酶溶液（已配好）
液，重复上述操作，分别测出V30、V20、V10。
利用上述结果，以1/v对1/[s]作图，即求出V与 Km值。
注意事项
（1 ）实验表明，反应速度只在最初一段时间内保持恒定， 随着反应时间的延长，酶促反应速度逐渐下降。原因有多种， 如底物浓度降低，产物浓度增加而对酶产生抑制作用并加速 逆反应的进行，酶在一定pH及温度下部分失活等。因此，研 究酶的活力以酶促反应的初速度为准。
此方程表明，当已知Km及V时，酶反应速度与底 物浓度 之间的定量关系。
双倒数作图法测定Km值： 1 Km 1 1 v V [S] V
胰蛋白酶的性质 胰蛋白酶催化蛋白质中碱性氨基酸（L-精 氨酸和L-赖氨酸）的羧基所形成的肽键水解， 产生自由氨基端。
氨基的测定
甲醛滴定法
COOCH2 NH2
HCHO
实验十六
底物浓度对酶促反应速度的影响 ——米氏常数的测定
目的要求
（1）了解底物浓度对酶促反应的影响。
（2）掌握测定米氏常数Km的原理和方法
实验原理
Km定义： Km值等于酶促反应速度达到最大反应速度一半时 所对应的底物浓度。
Km的意义
Km是酶的特性常数之一，不同的酶Km值不同，同
一种酶与不同底物反应Km值也不同。
器材：
碱式滴定管
操作方法
1 ．取 50mL三角瓶 4 个，加入 5mL 甲醛与 1 滴酚酞，以 0.1M 标准 NaOH滴定至微红色， 4 个瓶颜色应当一致，编 号。 2 ．量取 40g/L 酪蛋白 50mL，加入一 150mL 三角瓶， 37℃保温10分钟，同时胰蛋白酶液也在37℃保温10分钟， 然后吸取5mL酶液加到酪蛋白液中。（同时计时！）充分 混合后立即取出10mL反应液（定为0时样品）加入一含甲 醛的小三角瓶中（1号）加10滴酚酞；以0.1M NaOH滴定 至微弱而持续的微红色。在接近终点时，按耗去的 NaOHmL数，每mL加一滴酚酞，再继续滴至终点，记下 耗去的0.1M标准NaOH mL数。
（2 ）本实验是一个定量测定方法，为获得准确的实验结 果，应尽量减少实验操作中带来的误差。因此配制各种底物 溶液时应用同一母液进行稀释，保证底物浓度的准确性。各 种试剂的加量也应准确，并严格控制准确的酶促反应时间。
思考题
1. 试述底物浓度对酶促反应速度的影响。 2. 试述在何种条件下，测定酶的Km值可以作为鉴 定酶的一种手段。 3 米氏方程中的Km值的实际应用是什么？ 4 本实验中的注意事项是什么？
3．在2分钟、4分钟、6分钟时，分别取出10mL反应 液，加入2号、3号、4号小三角瓶，同上操作，记下耗 去NaOH mL数。 以滴定度（即耗去的NaOH mL数）对时间作图，
得一直线，其斜率即初速度为V40（相对于40g/L
的酪蛋白浓度）。 然后分别量取30g/L、20g/L、10g/L的酪蛋白溶
Km值可近似的反应酶与底物的亲和力大小： Km 值大，表明亲和力小；Km值小，表明亲和力大。 测定Km值是酶学研究的一个重要方法。
米氏方程： V[S] v = Km + [S ]
v : 反应初速度 （微摩尔浓度变化/min) V : 最大反应速度 （微摩尔浓度变化/min) [S]：底物浓度 （mol/L) Km: 米氏常数 （mol/L)