垂直板聚丙烯酰胺 凝胶电泳分离乳酸 脱氢酶同工酶
（活性染色鉴定法）
实验目的：
• 理解同工酶的概念及遗传学意义 • 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 • 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 • 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
同工酶
是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫 学性质不同的一组酶。它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达 的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同。
实验流程
一、动物组织的样品的获取 二、试剂的配制、仪器的准备 三、分离胶（30分钟） 四、浓缩胶（20分钟） 五、电泳（2-3小时） 六、染色（30分钟） 七、观察结果
一、试剂：
1.凝胶储备液： A储备液： pH8.9 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加 双蒸水到
本实验做的是乳酸脱氢酶（LDH）的分离鉴定。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理
天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、 形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。
多数蛋白质的pH在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中进行 电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；
• 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加100ul 甘油和10ul 溴酚蓝，混匀之后即可点样。
三、分离胶的制备
储备液
配方表 A储备液 C储备液 双蒸水 E储备液
TEMED 总体积
用量（ml）2.5
5.0
12.5 100ul
10ul
20
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。胶高度距样品凹玻璃板 下缘约1cm，用移液枪在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层水以隔绝空 气，并使胶面平整。
1
1.电泳槽
2.梳子 3
3.制胶器
4.夹胶框 2
封胶条
4
二、样品的制备
• 取材：鲫鱼若干条，解剖取眼、鳃、肺、肝、肠、肉、卵 、 心脏，放入冰箱保存。
• 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需4℃预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之 比为１：5。用研钵研磨充分。浆液4℃离心约30分钟， 15000转／分钟。
• 水与凝固的胶面有折射率不同的界限，用滤纸吸去多余的水。
四、浓缩胶的制备
储备液
用量 （ml）
B储备 液
1.25
配方表
D储备 液
2.5
双蒸水 F储备 液
1.2
5
E储备 液
60ul
TEME D
16ul
总体积 10
• TEMED最后一个加入，轻轻混匀，操作迅速。浓缩胶液高度到凹玻璃 板下缘0.5cm左右，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。约30分钟后， 凝胶完全。
80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 B储备液 ： pH6.7 Tris~HCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到
80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 C储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容
到100ml，备用，4℃存放可以保存1个月。 D储备液： 浓缩胶储备液：16g Acr，4g Bis，用双蒸水定容到 100ml，备用，
3.乳酸脱氢酶染色剂的配制 1M －乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M Tris－Hcl溶液（PH8.0）2ml 去离子水定容至50ml
器材：
夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳压电源（电压300-600V， 电流50-100mA），移液枪（各种量程），烧杯（100mL）， 培养皿
• 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？ 分别有何用途？
•谢谢
附：分离胶、浓缩胶配方
储备液 A储备 液
用量
2.5
（ml）
C储备 双蒸水 E储备液 TEME 总
液
(APS)
D
体积5.ຫໍສະໝຸດ 12.5 100ul 10ul 20
储备液
用量 （ml）
B储备液 1.25
D储备液 2.5
双蒸水 1.2
F储备液 5
4℃可以保存1个月。 E储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20℃保存。 F储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED
2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用 时 稀释10倍。
E储备液 TEME 总
(APS)
D体 积
60ul 16ul 1 0
感谢下 载
带孔胶
小分子
按分子 大小分离
聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型
连续系统
相同孔径的凝胶、缓冲系统，是利用蛋白质分子的主要靠 电荷和分子筛效应进行分离。
不连续系统
不同孔径的凝胶和不同缓冲体系的电泳方式，在电泳分离过 程中，由于浓缩胶的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶 的界面上先浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，浓缩效应，然 后在一定浓度或浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效 应，也有分子筛效应。
• 观察拍照
m：肌肉（muscle）；l：肝脏（liver）；k：肾脏 （kidney）；s：脾脏（spleen）；h：心 （heart）； e：眼睛（eye）；f：鳍（fin）；g： 鳃（gill）；b：脑（brain）
思考题：
• 根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺 凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？
• 小心拔出样品梳（两端同时向外拔）。
点样
加样
样品迁 移方向
五、电 泳
• 电压和电流：电压180V， 电流流18－30mA； • 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。
六、染色与观察
• 揭去上面长型玻璃板，凝胶从短型玻璃板上剥离，慢慢地把 胶板冲入白瓷盘或大培养皿内，避光于37度摇床中染30min。
对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而 向阴极迁移，称为阴极电泳。
电泳 缓冲液
加在槽中的样品
夹在两块玻璃 板之间的凝胶
电泳 缓冲液
电源
分子量大 分子量小
电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。
电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。
电泳方向
混合样品 电泳
大分子