文章编号： １０００－１３３６（２００９）01－0134-04纳豆激酶聂光军 岳文瑾（安徽工程科技学院生物化学工程系，芜湖２４１０００）摘要：纳豆激酶是一种枯草杆菌酶，具有较强的纤溶活性和溶栓功能，是一种治疗心脑血管疾病的理想候选药物。

目前，纳豆激酶分离方法、纳豆激酶功能、结构及其应用、纳豆激酶工程菌构建已成为纳豆激酶的研究热点，也成为未来纳豆激酶研究的导向。

关键词：纳豆激酶；基因工程菌中图分类号：Ｑ５５收稿日期：　２００８－０９－２４安徽省高校自然科学基金项目（ＫＪ２００７Ｂ１１４）；芜湖市科技计划重点项目（２００７－１２６）资助作者简介：聂光军（１９７６－），男，硕士，讲师，联系作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｏｉｎ－ｕｓ＠１６３．ｃｏｍ；岳文瑾（１９７９－），女，硕士，讲师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｙｕｅｗｅｎｊｉｎ＿７９＠１６３．ｃｏｍ目前，全球每年因血栓病致死人数达１２００万人，接近世界总死亡人数的四分之一。

抗血栓药物需求量很大，但临床使用的抗血栓药物普遍存在着稳定性差和药效短等缺点，迫切需要一种低价高效、易吸收、体内半寿期长以及使用方便的治疗心脑血管疾病的药物或保健品。

纳豆激酶（ｎａｔｔｏｋｉｎａｓｅ，　ＮＫ）是一种高效血栓溶解酶，具有较好的纤溶活性和溶栓功能，它源于传统发酵食品，生产工艺简单，安全性高［１］。

因此，世界上很多国家都在研究ＮＫ，其中日本的研究较为广泛深入。

我国很多高校和研究院所也在进行ＮＫ的研究。

近期研究主要包括ＮＫ的酶学性质、结构、功能及其应用研究，以及ＮＫ的提取工艺、工程菌构建等。

１． ＮＫ的稳定性影响ＮＫ稳定性的主要因素有温度、ｐＨ值和金属离子等。

ＮＫ低于４５　ºC 时活性相对稳定，高于６０ºC 逐渐失活，反复冻融５次后，该酶仍能保持９５％以上的活性。

室温下，在ｐＨ　７￣１２范围内较为稳定，ｐＨ　７￣９范围内酶活性最为稳定，但ｐＨ＜５性质则不稳定。

王萍等报道［２］ＮＫ纤溶活性最适ｐＨ为８．０，ｐＨ　６￣１０溶液中４０　ºC 以下基本稳定，ｐＨ＜５失去纤溶活性。

模拟胃环境的酸性条件下，粗酶失去纤溶活性，而纳豆浸提液纤溶活性保持２５％。

与煮沸的米汤、肉汤或血清蛋白、胃黏液混合可以明显提高该酶的稳定性，甚至在ｐＨ　２￣３的酸性条件还可保持７．５％的活性［３］，因此，ＮＫ在黏性环境下可提高耐酸性，进而推测其在胃肠中具有较好的稳定性，进一步验证其具有口服药物的开发价值。

此外，添加甘油、丙二醇、牛血清蛋白、明胶、海藻酸钠等也有利于提高酶的热稳定性。

ＮＫ的活性还受一些金属离子的影响。

Ｈｇ２＋会使其完全失活，Ｃｕ２＋、Ｚｕ２＋、Ａｌ３＋、Ｃａ２＋等离子对该酶有不同的抑制作用，而Ｍｇ２＋、Ｃｏ２＋则对其有激活作用。

此外，１　ｍｍｏｌ／Ｌ　ＤＦＰ（二异丙基氟磷酸）和５　ｍｍｏｌ／Ｌｎｅｇｕｖｏｎ则能完全抑制ＮＫ的活性［４］。

２． ＮＫ活性中心的保守性和底物的特异性ＮＫ具有保守性的催化中心（Ｄ３２、Ｈ６４、Ｓ２２１和Ｎ１５５），如图１、２所示，在与不同底物反应时，其催化中心的位置及氨基酸组成都没有发生变化。

研究发现ＮＫ对血浆纤溶酶底物Ｈ－Ｄ－Ｖａｌ－Ｌｅｕ－Ｌｙｓ－ｐＮＡ最敏感，对凝血酶底物Ｓ－２２３８（Ｈ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｐｉｐ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）和激肽释放酶底物Ｓ－２３０２（Ｈ－Ｄ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－Ａｒｇ－ｐＮＡ）也有一定活性，而对尿激酶底物Ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｇｌｙ－Ａｒｇ－ｐＮＡ和弹性蛋白酶底物Ｐｙｒｏ－Ｇｌｕ－Ｐｒｏ－Ｖａｌ－ｐＮＡ不起作用。

另据报道［５］，ＮＫ对枯草杆菌蛋白酶和糜蛋白酶的底物Ｓｕｃ－Ａｌａ－Ａｌａ－Ｐｒｏ－Ｐｈｅ－ｐＮＡ也有高度水解活性。

以氧化型胰岛素Ｂ链为作用底物，研究ＮＫ的酶切特性，发现ＮＫ有严格的识别位点及限制性酶切位点：首选酶切位点在Ｌｅｕ１５－Ｔｙｒ１６；其次在Ｓｅｒ９－Ｈｉｓ１０；在Ｇｌｎ４－Ｈｉｓ５及Ｈｉｓ５－Ｌｅｕ６也有微弱的水解活性。

因此，ＮＫ催化中心是保守的，其底物具有特异性。

３． ＮＫ的分离提取ＮＫ是胞外酶，与细胞、细胞碎片、其他代谢产物、残存底物及惰性组分等混合在一起，分离难度大，成本高。

目前，对于ＮＫ的分离纯化研究很多，艺已较成熟。

３．１　传统的分离方法 ＮＫ传统的分离方法是从固体发酵纳豆中分离纯化ＮＫ，并经过４次盐析，３次层析操作。

因此该分离工艺步骤多，时间长，导致产品得率偏低（１８％￣５０％），分离成本提高以及活性降低等问题。

为了解决上述问题，采用发酵与泡载偶合的分离方法，初步纯化ＮＫ，再经超滤脱盐，层析，分离得到了比活为９８００　ＩＵ／（ｍｇ蛋白质）的ＮＫ，回收率为８５．５％。

刘俊果等［７，８］采用反胶团萃取技术分离ＮＫ，该方法步骤少、选择性高、成本低，经过一次萃取循环，蛋白质回收率为３３．２５％，酶活性回收率为８０％。

３．２　双水相亲和分配技术 目前，改进生物分离方法最主要的工作是缩短流程和提高单元分离的效率。

分离技术的高效集成化使生物分离过程出现一个质的转变，即利用已有的或新近开发的生物分离技术，将下游过程中的有关单元进行有效集成，或者把两种以上的分离技术合成为一种更有效的分离技术，达到提高产品得率、降低过程能耗和增加生产效益的目标。

亲和层析法的优点是选择性高、步骤少，但发酵液须经过一系列的前处理才能进行分离，而双水相分配技术则可以直接处理液固混合物，因此，二者结合可形成处理量大、效率高、选择性强的双水相亲和分配组合技术。

陆瑾等［９］对ＰＥＧ４０００的羟基进行活化，以亚氨基二乙酸（ＩＤＡ）为螯合剂，制取含有Ｃｕ２＋的金属螯合亲和配基ＰＥＧ－ＩＤＡ－Ｃｕ（ＩＩ），并以ＰＥＧ和羟丙基淀粉（ＰＥＳ）形成双水相，用于直接处理ＮＫ的发酵液，如图３所示，经过两次分配分离流程后，ＮＫ的总回收率为８１％，纯化因子达到３．５２。

３．３　膨胀床吸附技术 膨胀床吸附技术（ＥＢＡ）是一项在产物捕获阶段实现的过程集成生物分离技术，集固液分离、浓缩和初期纯化于一体，能直接从含有固体颗粒的发酵液捕获目标产物，减少操作步骤，降低分离过程的复杂程度，提高分离效率和产品的得率。

胡洪波等［１０］采用了离子交换型膨胀床吸附剂对发酵液中的ＮＫ进行了分离纯化，并与传统分离工艺进行了比较。

结果表明，传统分离方法设备需求多、药品消耗大。

与传统方法相比，膨胀床法分离纯化ＮＫ，操作步骤从６步减少为２步，操作时间缩短了８￣１０小时，回收率提高了约５０％。

３．４　基因重组定向分离技术 基因重组技术促进了代谢产物定向分离技术的发展，为生物分离技术的发展开辟新的研究领域。

Ｌｉ等［１１］应用ＤＮＡ重组技术，图１　ＮＫ与Ｈ－Ｄ－ＶＬＫ－ｐＮＡ结合的三维模式图［６］ 图２　ＮＫ与底物Ｓｕｃ－ＡＡＰＦ－ｐＮＡ结合的三维模式图［６］将编码六个组氨酸的核苷酸序列整合入ＮＫ基因序列的末端，编码形成带有六个组氨酸标记尾巴的ＮＫ蛋白，在通过与六组氨酸具有较强亲和力的Ｎｉ２＋分离ＮＫ蛋白，获得ＮＫ蛋白分子量为３０　ｋＤａ，活力为６０　Ｕ／ｍｌ，增加了ＮＫ分离手段，为定向分离ＮＫ提供了参考依据。

４． ＮＫ工程菌的构建应用基因工程技术生产ＮＫ不仅产量高、活性强，并且有利于代谢产物的分离、纯化。

朱立成等［１２］将编码信号肽、前导肽和成熟肽在内的ＮＫ基因克隆到原核表达载体ｐＥＴ２８ａ＋中，获得重组表达质粒ｐＥＴＮ　Ｋ，将此重组表达载体质粒转化到大肠杆菌ＢＬ２１中。

结果表达的ＮＫ融合蛋白分子量大约为３１ｋＤａ，利用蛋白质印迹分析ＮＫ融合蛋白，酶免疫法检测该蛋白质具有较好的纤溶活性。

张立全等［１３］ＰＣＲ扩增获得８３７　ｂｐ的ＤＮＡ片段，将该基因片断克隆到ｐＭＤ１８２Ｔ　载体上，构建重组表达载体，然后将其转化至大肠杆菌ＢＬ２１　（ＤＥ３）ｐｌｙｓＳ后，经ＩＰＴＧ诱导在大肠杆菌中高效表达，应用ｂａｎｄｓｃａｎ软件分析融合蛋白质分子量约为３３．４　ｋＤａ，约占菌体总蛋白质的２９．４％。

此外，应用ＤＮＡ重组技术构建一些能够利用发酵过程中部分不利影响因子的工程菌，以改良纳豆菌的生产代谢。

Ｐｏｔｉｎｇ等［１４］应用基因重组技术，构建重组ＮＫ产生菌，消除发酵培养基中谷氨酸盐和一些金属离子等抑制因子对ＮＫ生产的不利影响，将ＮＫ酶的产量提高了４倍。

张锋等［１５］将编码ＮＫ的基因克隆到含ＣａＭＶ３５Ｓ控制下的双元表达载体ｐＣＡＭＢ　ＩＡ　１３００中，再将重组子导入根癌农杆菌ＬＢＡ４４０４中，从而成功地构建了能在植物中高效表达的植物反应器，为生产ＮＫ开辟了一条新途径。

５． ＮＫ的应用目前，链激酶和尿激酶等药物已在临床上发挥重要作用，但因其价格昂贵、用药剂量大、体内稳定性差等问题，很难作为口服制剂进行有效推广。

ＮＫ可直接将纤维蛋白水解成小肽和氨基酸，不像其他的溶栓药物通过激活靶酶与纤维蛋白结合，发挥溶栓作用，而自身不能直接作用于纤维蛋白。

实验表明口服ＮＫ后优球蛋白的纤溶活性（ＥＦＡ）和纤维蛋白降解底物（ＦＤＰ）值迅速升高，纤维蛋白迅速降解，并刺激血管内皮细胞引起ｔ－ＰＡ的不断增加，第４天达到最高，是未服用ＮＫ时的１．４倍，进一步增加了人体的纤溶活性。

此外，ＮＫ可通过肠道迅速吸收并释放入血，溶栓效率高，药效时间长，可开发为新型口服溶栓、防栓制剂和保健类饮品。

由于ＮＫ能纤溶酶原激活因子抑制子的活性，激活静脉内皮细胞，引起ｔ－ＰＡ的继发性增加，同时激活尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）转变为尿激酶，使内源性纤溶酶量和活性间接增强，具有双重功能。

因此，ＮＫ被应用于狗的血栓模型实验及健康人群的体内研究［１６］。

目前，世界各国积极开发ＮＫ产品，日本、韩国、朝鲜等国已研制出多种以ＮＫ为主要成分，与其他酶复合生成的复合酶粉剂、片剂、软硬胶囊、口服液或保健食品或饮品［１７］。

如日本大和制药有限公司和温翠普－圣特公司同时开发的ＮＫ硬胶囊、软胶图３ 双水相亲和分配技术分离纯化ＮＫ过程示意图［９］囊和片剂３种剂型的功能性食品［１８］。

日本的过敏症研究集团天然保健品研究开发公司也开发生产了含ＮＫ的复方制剂真保健公司推出的名为“云香苷酶”牌ＮＫ天然酶制剂产品，主要调节体内免疫系统平衡。

ＮＫ还可以溶解细胞壁附近血栓和抑制血管内壁增厚老化的作用。

迟东升等［１９］研究表明纳豆粗提物可降低血脂水平，通过升高高密度脂蛋白胆固醇、降低低密度脂蛋白胆固醇调节脂质代谢，具有抗脂质过氧化和调节脂肪的作用。

此外，２００５年，Ｚｈｅｎｇ等发现了一种催化产ＮＫ的新型核酸催化剂［６］。

６． ＮＫ的研究展望目前，国际上ＮＫ产品已经走俏市场。

国内ＮＫ产品也有着广阔的市场前景，我国有１３亿多人口，　人口渐趋老龄化，心血管疾病致死率不断攀升，且有向低龄化发展的趋势。

因此，ＮＫ产品在国内市场不但容量大，而且产品种类需求多。

所以，对ＮＫ的研究展望如下：（１）应用信息化手段研究ＮＫ的结构，分析测试ＮＫ的功能和作用机理，拓宽ＮＫ的使用范围，开发不同剂型的ＮＫ药物，尤其是防治心血管疾病药物的研制与开发。