实验指导实验一小动物线虫的形态观察[实验目的及要求]熟悉线虫的基本构造，掌握小动物常见线虫的主要形态特征。

[实验材料和试剂]光学显微镜，手持放大镜，镊子，解剖针，平皿，载玻片与盖玻片。

乳酸酚透明液。

浸渍标本：钩口科线虫、尾旋科线虫等，病理标本。

[实验内容]（一）线虫的一般形态构造圆柱状，两端逐渐变细，有的呈线状或毛发状。

整个虫体一般可分为头端、尾端、背面、腹面及侧面。

雌雄异体，雄虫较小后端弯曲。

1 体表：线虫的体表为一层无色、略半透明的角质所覆盖。

许多角皮还分化形成了多种特殊组织构造，包括头泡、颈泡、唇、叶冠、颈翼、侧翼及尾翼、尾感器等。

2 消化系统：线虫消化系统呈管状。

包括口腔、肌质结构的食道和管状的肠。

3 排泄系统：分原始的腺型和管型两类，无尾感器线虫为腺型，有尾感器的线虫排泄系统为管型。

4 神经系统：神经环是线虫神经系统的中枢，位于食道周围。

5 生殖系统：线虫为雌雄异体，生殖系统均为丝状管道。

雄虫生殖器官通常为单管状，由一个睾丸、一个输精管、贮精囊以及一个通向泄殖腔的射精管组成，末端有辅助生殖器。

雌虫生殖器官通常为双管型，由卵巢、输精管、受精囊、子宫、阴门和一般较短的阴道组成。

有的线虫有排卵器。

6 虫卵: 大小差异很大，卵膜由内膜、中间层和蛋白膜组成。

（二）小动物常见线虫及虫卵形态特征1．犬恶心丝虫双瓣科、恶丝虫属。

寄生于犬的右心室和肺动脉。

成虫细长白色。

雄虫尾部呈现螺旋状卷曲。

120~160mm2．犬弓首蛔虫弓首科，弓首属。

寄生于犬和犬科动物的小肠。

虫体浅黄白色，头端三片唇。

虫卵近于球状，表面不光滑。

50~110mm3．猫弓首蛔虫弓首科，弓首属。

寄生于猫和猫科动物的小肠中。

与犬弓首虫相似，只是颈翼膜短而宽，虫体前端如箭头状。

40~100mm4．鸡翼刺线虫尖尾目，异刺科，异刺属。

寄生于鸡鸭鹅等的盲肠。

白色小型线虫。

7~13mm5．毛细线虫寄生于犬、猫的支气管和气管内。

虫体细长，乳白色。

雄虫体长15~25mm，尾部有2个尾翼和一根带鞘的交合刺。

雌虫长20~40mm，阴门开口于接近食道的末端。

虫卵呈腹鼓形，卵壳厚，两端各有一个卵塞。

6．钩虫虫卵椭圆形，壳薄，无色透明。

卵内多有4~8个胚细胞，胚细胞与卵壳间有明显的空隙。

7．类圆线虫类圆线虫寄生于犬、猫的小肠。

雄虫尾端向腹面卷曲，具2根交合刺。

雌虫半透明，体表具细横纹，尾部尖细，子宫前后排列，其内各含8~12个虫卵。

8．类圆线虫虫卵虫卵为椭圆形，壳薄、无色透明，形态与钩虫卵相似，但部分虫卵内含有幼胚。

[实验计划]1．分别用肉眼和显微镜观察各种线虫的形态特征，了解熟悉其分类位置。

2．镜下观察各种蛔虫卵、钩虫卵等，注意各自特点。

3．清理实验用品，完成课堂作业。

[思考]1．画出线虫的基本形态构造图，并注明各构造名称。

2．描述各种线虫的形态特征，及宿主和寄生的部位。

3．What is the structure of eelworm’s eggs?实验二小动物寄生虫病的免疫诊断技术目前兽医寄生虫主要的诊断方法有临床诊断、病原学检测、免疫学检测、分子生物学检测，现在详细介绍四个实验来学习小动物寄生虫病的免疫诊断技术：间接血凝实验，乳胶凝集实验，酶联免疫吸附实验，免疫印迹技术。

（一）间接血凝实验[实验原理]间接血凝试验（Indirect Haemagglutination Test，IHA）是将可溶性抗原吸附在比其体积大千万倍的红细胞表面上，使红细胞产生一种新的血清学性质，制成所谓的的致敏红细胞，即可用于诊断病原。

只要与少量相应的抗体相遇，红细胞通过抗原抗体反应，即可被动地结合在一起，呈现肉眼可见的凝集现象。

[主要试剂和器材]冰箱；震荡器；96孔血凝板；移液器；稀释液；阳性对照血清；阴性对照血清；致敏红细胞；被检血清[实验步骤]1．先将96孔血凝板按血清编好号，每份血清一排（8孔），每一板都设阳性和阴性血清各一排，每排最后一孔为致敏红细胞空白对照。

2．每孔加入稀释液75ul，吸取待检血清25ul，加于每排第一孔，自左至右按次序作4倍稀释，混合至第七孔时弃25ul混合液,最后一孔作空白对照,同时有两排孔分别做阴、阳性对照。

3．将诊断液摇匀，每孔加诊断液25ul，加完后将血凝板在微型振荡器上振荡，在25℃左右恒温静置2-3小时可判断结果。

4．红细胞呈膜状均匀沉于孔底，中央无沉点或沉点小如针尖，判为“＋＋＋＋” 。

[结果判定]1．红细胞虽呈膜状沉着，但颗粒较粗，中央沉点较大，判为“＋＋＋”。

2．红细胞部分呈膜状沉着，周围有凝集团点，中央沉点大，判为“＋＋”。

3．红细胞沉集于中心，周围有少量颗粒状沉着物，判为“＋”。

4．红细胞沉集于中心，周围无沉着物，分界清楚，判为“－”。

5．以出现“＋＋”孔的血清最高稀释倍数定为本间接血凝试验的凝集效价。

小于或等于1∶16判为阴性；等于或大于1∶64判为阳性。

[注意事项]1．红细胞浓度：致敏红细胞浓度与实验的敏感性和特异性有密切关系，必须选择合适的浓度范围。

2．用微量稀释器稀释血清准确、快速，使用方便。

3．血凝板使用后用10%过氧乙酸浸泡，常在孔底有变性蛋白沉积而出现假阳性，用15%安替福民（NaOCl）处理无假阳性。

[思考]1．怎样用间接血凝法检测红细胞上所带的特异性抗原？2．分析间接血凝试验中出现假阳性现象的可能原因有那些？3．What are appearances of the positive sample in IHA?（在间接血凝实验中，阳性样品有什么表现？）（二）乳胶凝集实验[实验原理]乳胶凝集实验（Latex Agglutiination Test,LAT）是凝聚反应的一种，在特定条件下将寄生虫抗原与乳胶相连，使成为颗粒性抗原。

这种抗原与寄生虫感染者血清中特异性抗体结合后，即形成抗原抗体复合物，在适当条件下，经过一段时间，乳胶颗粒凝集在一起，显示肉眼可见的凝集团块，即为阳性反应，否则为阴性反应。

[材料仪器]乳胶抗原，待测血清，生理盐水，玻璃板，微量加样器。

[操作步骤]1．用生理盐水1：10稀释待检血清。

2．在乳胶试验玻璃板上滴加上述已稀释待测血清50ul，加入乳胶抗原50ul，轻轻摇动，充分混匀。

3．25℃作用5~10min，观察结果。

[结果判断]阳性反应：呈现清晰的凝集颗粒。

阴性反应：无明显凝集颗粒。

[注意事项]1．每次检测均要设置阴性和阳性血清做对照，。

2．乳胶抗原应避免冰冻，4℃可保存。

3．实验中应避免待测样品互相弥混。

4．观察实验结果应该在光亮处进行。

[思考]为什么乳胶凝集实验中阳性血清能够和颗粒性抗原凝集成团块？（三）酶联免疫吸附实验[实验原理]酶联免疫吸附实验（Enzyme-Linked ImmunosorbentAssay,ELISA）是一种免疫标记技术。

其原理是根据酶具有强大的催化作用和抗原抗体反应的高度特异性特点，在不破坏酶活性和抗原抗体特性的前提下，通过化学交联，或免疫学方法，将酶分子，联结到抗原或抗体分子上，然后与特异性抗原或抗体反应，形成酶标记免疫复合物。

结合在免疫复合物上的酶，在遇到相应的底物时，催化其水解，生成肉眼可见的颜色变化，从而用比色法判断结果。

用于标记的酶应具有以下特点：1 有高浓度的特异性活性和敏感性；2 在室温下稳定；3易于获得并能商业生产；4 与底物反应后的产物易于显现。

目前，应用较多的有辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、酸性磷酸酶等。

[仪器材料]酶标二抗、包被液、PBS-Tween20 洗液、封闭液、酶底物、抗原、待测血清、聚乙烯酶标板、微量加样器、振荡器、酶标仪。

[操作步骤]1．用包被液稀释抗原至合适浓度，加入酶标板，每孔50ul，4℃过夜或37℃1h2．弃包被液，PBS-Tween20洗涤3~5次，加100ul封闭液，4℃过夜或37℃1h3．弃封闭液，PBS-Tween20洗涤3~5次，加待检血清50ul，4℃过夜或37℃1h4．弃血清，PBS-Tween20洗涤3~5次，加酶标二抗50ul，37℃1h 5．弃二抗，PBS-Tween20洗涤3~5次，加显色液100ul，避光反应5~15min，每孔加50ul2mol/L硫酸终止反应，酶标仪测量吸光值。

[结果判断]1．一般颜色反应吸收值大于0.2的样品为阳性。

2．样品若作梯度稀释，仍然可以出现阳性反应的最高稀释度即为该样品的滴度。

3．用P/N比表示亦可。

样品的吸收值与阴性对照吸收值的比值大于2判为阳性。

[注意事项]1．应设置阴性和阳性血清对照2．显色液现配现用。

3．显色反应避光进行，反应时间要适宜，过长假阳性增多。

[思考]1．酶联免疫吸附实验的原理是什么？2．what are the enzyme’ characteristics we used in ELISA?（四）免疫印迹技术(Immunoblotting technique)[实验原理]免疫印迹技术 (Western blot)是由SDS-PAGE，蛋白质转移电泳以及ELISA结合而成的一种酶标免疫检测技术。

印迹是指把大分子物质从胶上转移至固体介质的过程。

把DNA从琼脂糖凝胶上转移至纤维素膜上称为Southern印迹，RNA称为Northern印迹，蛋白质则称为Western印迹。

首先将可溶性抗原经过SDS-PAGE按抗原分子量大小分离出若干条带，再将蛋白分子电转移到硝酸纤维（NC）膜上，印有抗原分子的NC膜切成条带，置于反应槽中加待测血清，和酶标二抗，按Dot-ELISE。

[材料仪器]待见寄生虫抗原，蛋白质标准分子量，阳性血清，HRP标记二抗。

蛋白质加样缓冲液，12%分离胶（10ml），5%浓缩胶，SDS-PAGE 电泳缓冲液，转印缓冲液，NC膜，显色液，电泳槽，电泳仪，微量加样器，离心机，摇床。

[操作步骤]1．制备抗原样品，500ul寄生虫抗原中，加入500ul蛋白质加样缓冲液，100℃加热10min，12000g离心3min。

2．在聚丙烯酰胺凝胶加样孔中加抗原15ul，加150V典雅电泳约2h。

3．切下凝胶，从阴极到阳极依次在电转装置上依次加海绵垫、滤纸、凝胶、NC膜、滤纸、海绵垫，夹紧，于电转缓冲液中，100V电泳1h。

4．取NC膜，PBS洗膜2次，0.2%丽春红染色，铅笔标记蛋白质标准分子量所在位置。

PBS洗膜数次，至丽春红全部褪去，3%BSA(PBS)4℃过夜或37℃1h。

5．PBS洗膜数次，加阳性血清，37℃作用1h6．生理盐水洗膜数次，加酶标记二抗，37℃作用1h7．生理盐水洗膜，加底物显色，生理盐水漂洗，PBS终止反应。

[结果判断]阳性：在相应分子量大小处出现清晰的显色条带。

阴性：在理论位置无显色条带。

[注意事项]1．电转移时，保证海绵垫、滤纸、凝胶、NC膜之间无气泡。

2．封闭液可用5%脱脂奶粉代替，封闭的好坏和NC膜染色时的背景高低无关。