第三章发酵工程第一节绪论远古时代已经有发酵工程：酿酒、造醋、制面包等。

发酵已经从过去简单的生产酒精类饮料、生产醋酸和发酵面包发展到今天成为生物工程的一个极其重要的分支，成为一个包括了微生物学、化学工程、基因工程、细胞工程、机械工程和计算机软硬件工程的一个多学科工程。

现代发酵工程不仅生产酒精类饮料、醋酸和面包，而且生产胰岛素、干扰素、生长激素、抗生素和疫苗等多种医疗保健药物，生产天然杀虫剂、细菌肥料和微生物除草剂等农用生产资料，在化学工业上生产氨基酸、香料、生物高分子、酶以及维生素和单细胞蛋白等。

发酵工程从广义上讲，由三部分组成：上游工程、发酵工程、下游工程。

上游工程包括：基因工程或细胞工程，种子培养，培养基配制，灭菌，接种。

下游工程包括：产物提取和纯化，废弃物处理，产品的获得。

一、发酵工程定义：发酵工程（fermentation engineering）主要指在最适发酵条件下，在生物反应器中大量培养细胞和生产代谢产物的工艺技术。

发酵工程是生物技术产业化的基础和关键技术，无论传统发酵产品，如抗生素、氨基酸等，还是现代基因工程产品，如疫苗、人体蛋白质等，都需要发酵技术进行生产。

1．传统发酵最初发酵是用来描述酵母菌作用于果汁或麦芽汁产生气泡的现象，或者是指酒的生产过程。

ferver：发泡、沸腾——fermentation发酵现象的本质①显微镜观察：微生物（列文虎克）②著名的巴斯德实验：微生物作用（1857年法国化学家、微生物家巴斯德（Pasteur）提出了著名的发酵理论：“一切发酵过程都是微生物作用的结果。

”）巴斯德认为，酿酒是发酵，是微生物在起作用；酒变质也是发酵，是另一类微生物在作祟；随着科学技术的发展，可以用加热处理等方法来杀死有害的微生物，防止酒发生质变。

同时，也可以把发酵的微生物分离出来，通过人工培养，根据不同的要求去诱发各种类型的发酵，获得所需的发酵产品。

③著名的毕希纳实验：酵素（酶）的作用（1897年德国化学家毕希纳（Buchner）发现磨碎的酵母仍使糖发酵形成酒精———酶）2．生化和生理学意义的发酵指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，发酵是以有机物作为电子受体的氧化还原产能反应。

如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出CO2。

3．工业上的发酵泛指利用微生物制造或生产某些产品的过程。

包括：①厌氧培养的生产过程，如酒精，乳酸等。

②通气（有氧）培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等。

产品有细胞代谢产物，也包括菌体细胞、酶等。

4．对发酵现象的不同理解——两种角度（能量、产物）①生物化学家（侧重能量代谢）：A能够在氧分子参与下进行有氧呼吸产生能量的生物可以进行：有氧呼吸（氧供应充分、有机物氧化彻底、产生大量能量）和糖酵解（暂时缺氧、有机物氧化不彻底、产生少量能量）。

B无氧呼吸：特指那些不需要氧的微生物所进行的能量代谢。

指有机物经彻底或不彻底氧化，所脱下来的电子最后传给外源的无机氧化物（个别是有机氧化物）并释放较少能量。

生物化学家看待微生物发酵过程：发酵是酵母无氧呼吸产生能量的过程。

发酵是指有机化合物进行无氧代谢释放能量的过程。

厌氧发酵是厌氧菌借助氧化-还原反应释放能量的过程。

需氧发酵是好氧生物在受到分子态氧短缺限制时的不完全氧化释放能量的过程。

②工业微生物学家（侧重产品的生产）：发酵是利用微生物培养来生产产物的无氧或需氧的任何过程。

利用生物细胞（包括动、植物细胞）培养来生产产物的所有过程（需氧过程、细胞工程）。

5．发酵工程的内容：①有严格的无菌生长环境：包括发酵开始前采用高温高压对发酵原料和发酵罐以及各种连接管道进行灭菌的技术；在发酵过程中不断向发酵罐中通入干燥无菌空气的空气过滤技术；②在发酵过程中根据细胞生长要求控制加料速度的计算机控制技术；③种子培养和生产培养的不同的工艺技术。

④在进行任何大规模工业发酵前，必须在实验室规模的小发酵罐进行大量的实验，得到产物形成的动力学模型，并根据这个模型设计中试的发酵要求，最后从中试数据再设计更大规模生产的动力学模型。

⑤由于生物反应的复杂性，在从实验室到中试，从中试到大规模生产过程中会出现许多问题，这就是发酵工程工艺放大问题。

二、发酵工业的发展历史1．天然发酵阶段①纯培养技术的建立：巴斯德，科赫等。

人为地控制微生物的发酵进程。

②通气搅拌发酵技术的建立：青霉素的生产——深层培养③代谢控制发酵技术的建立：微生物进行甾体化合物的转化，Glu和Lys发酵生产。

对微生物具有高度专一性的酶反应作为合成手段的一部分加以利用，进行合理的代谢。

2．开拓发酵原料时期寻求更多更广泛的新型的发酵原料，如石油发酵，醋酸生产谷氨酸。

3．基因工程阶段采用酶学的方法，将不同来源的DNA进行体外重组，再把重组DNA设法转入受体细胞内，并进行繁殖和遗传下去。

人们能够根据自己的意愿将微生物以外的基因导入微生物细胞中，从而达到定向地改变生物性状与功能创新的物种，使发酵工业能够生产出自然界微生物所不能合成的产物。

三、发酵工业的范围1．以微生物细胞为产物的发酵工业定义：是以获得具有多种用途的微生物菌体细胞为目的的产品的发酵工业，包括单细胞的酵母和藻类、担子菌，生物防治的苏云金杆菌以及人、畜防治疾病用的疫苗等。

特点：细胞的生长与产物积累成平行关系，生长速率最大时期也是产物合成速率最高阶段，生长稳定期产量最高。

2．以微生物代谢产物为产品的发酵工业①对数生长期形成的产物是细胞自身生长所必需的，称为初级代谢产物或中间代谢产物。

②各种次级代谢产物都是在微生物生长缓慢或停止生长时期即稳定期所产生的，来自于中间代谢产物和初级代谢产物。

生产初级代谢产物和次级代谢产物所采取的发酵方法和注意事项不同。

3．以微生物酶为产品的发酵工业酶的特点：易于工业化生产，便于改善工艺提高产量。

分类：胞内酶和胞外酶。

生物合成特点：需要诱导作用，会遭受阻遏、抑制等调控作用的影响，因此在菌种选育、培养基配制以及发酵条件等方面需给予注意。

4、生物转化或修饰化合物的发酵工业定义：是利用生物细胞对一些化合物某一特定部位（基团）的作用，使它转变成结构相类似但具有更在经济价值的化合物。

最终产物是由微生物细胞的酶或酶系对底物某一特定部位进行化学反应而形成的。

5、微生物废水处理和其他①利用微生物消除环境污染②利用微生物发酵保持生态平衡③微生物湿法冶金④利用基因工程菌株开拓发酵工程新领域四、发酵方法的类别与流程1．发酵方法的类别：①根据对氧的需要区分：无氧和有氧发酵②根据培养基物理性状区分：液体和固体发酵③根据微生物生长特性区分：分批发酵，补料分批发酵和连续发酵④根据微生物种类区分：单菌种发酵和多菌种混合发酵2．发酵工程的流程：3．获得发酵产品的条件：①适宜的微生物②保证或控制微生物进行代谢的各种条件③进行微生物发酵的设备④精制成产品的方法的设备五、发酵工业的意义与展望①利用遗传工程等先进技术，人工选育和改良菌种②采用发酵技术进行高等动植物细胞培养③固定化技术广泛应用④开发和采用大型节能高效的发酵装置，自动控制将成为发酵生产控制的主要手段⑤应用代谢控制技术，发酵生产氨基酸⑥将生物技术理论广泛地用于环境工程第二节发酵工业菌种一、利用微生物的特点：1．对周围环境的温度、压强、渗透压、酸碱度等条件有极大的适应能力2．有极强的消化能力和极强的繁殖能力二、常用的工业微生物发酵工程所利用的微生物主要是细菌、放线菌，酵母菌和霉菌。

1．细菌乳酸杆菌、枯草杆菌、大肠杆菌等2．酵母菌酿酒酵母、假丝酵母属等3．霉菌曲霉属（米曲霉、黑曲霉）、青霉属（点青霉、产黄青霉）、根霉属（米根霉、小麦曲根霉）、红曲霉属（紫红曲霉）等4．放线菌链霉菌属、小单孢菌属等三、发酵工业菌种筛选原则与基本技术1．发酵工业菌种筛选的总趋势野生菌→变异菌自然选育→代谢控制育种诱发基因突变→基因重组的定向育种2．菌种选择的要求①能在廉价原料制成的培养基上迅速生长，且生成的目的产物产量高、易于回收；②生长速度和反应速度较快，发酵周期较短；③培养条件易于控制；④抗噬菌体及杂菌污染的能力强；⑤菌种不易变异退化；⑥对放大设备的适应性强；⑦菌种不是病原菌，不产生任何有害的生物活性物质和毒素。

3．分离筛选原理与技术新种分离与筛选的步骤：调查研究（包括资料查阅）→试验方案设计→含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微生物的可能性大？）→样品预处理→菌种分离即初筛（根据目的菌株及其产物特点来分，有两种分离方法）→纯化→复筛→纯化→再复筛→经初步工艺条件摸索和生产性能测试，选定较优菌株1-3株→保藏及进一步做生产试验或作为育种的出发菌株，还需进行某些必要试验和毒性试验等①如何使样品中含所需微生物的可能性大？采样时应注意的问题：土壤微生物的分布；采土深度；土壤植被情况；采样季节；土壤的酸碱度等②样品的预处理目的：提高分离效率；方法：物理方法包括热处理；膜过滤法；离心法等。

还有化学方法和诱饵法等。

③分离方法的选择：根据目的菌有无选择性特征来选择分离方法如果菌种的营养特征独特或菌种的生长特征独特则采用选择性分离方法无选择性特征则根据产物的特征进行随机分离ⅰ选择性分离方法的原理生长条件的选择与控制原理：控制营养成分、控制培养基酸碱度、添加抑制剂、控制培养温度、控制通气条件等。

ⅱ选择性分离技术：施加选择压力，进行定向筛选A富集液体培养技术是增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术。

其技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件。

B固体培养技术常用于分离某些酶产生菌。

施加选择压力的方式是在选择培养基中加入所需酶的基质。

选择性分离方法的关键在于生长培养条件的选择与控制，从而实现定向富集筛选。

ⅲ随机分离方法（用筛选方案-检测系统进行间接分离）从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。

其技术关键在于产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。

四、发酵工业菌种育种的基本技术工业菌种的育种是运用遗传学原理和技术对某个用于特定生物技术目的的菌株进行的多方位的改造。

通过改造，可使现存的优良性状强化，去除不良性状或增加新的性状。

1．菌种选育改良的具体目标：①提高目标产物的产量；②提高目标产物的纯度，减少副产物；③改良菌种性状，改善发酵过程；④改变生物合成途径，以获得高产的新产品。

2．基本技术①诱变是以微生物的自然变异作为基础的生产选种。

机率并不很高，因为一个基因的自然突变频率仅10-6~10-10左右。

②基因转移或基因重组是运用体外DNA各种操作或修改手法获得目的基因，再借助于病毒、细菌质粒或其他载体，将目的基因转移至新的宿主细胞并使其在新的宿主细胞系统内进行复制和表达，或者通过细胞间的相互作用，使一个细胞的优秀性状经其间遗传物质的交换而转移给另一个细胞的方法。