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氨基酸纸层析法（验证性）
相关知识
1. 层析法（色谱法）：是一种物理的分离方法。

它是利用混合物中各组分的物理化学性质的差别，使各组分以不同程度分布在两个相中，其中一个相为固定的（称为固定相），另一个相则流此固定相（称为流动相）并使各组分以不同速度移动，从而达分离。

2．几种常用的层析法
①吸附层析 ②离子交换层析 ③薄层层析 ④凝胶层析（凝胶过滤） ⑤亲和层析 ⑥分配层析（适于在水，有机溶剂中都可溶的混合物）
当把一种物质在两种不混溶的溶剂中振荡时，它将在这两相中不均匀的分配。

达到平衡时，这种物质在两种溶剂中的浓度之比是一个常数，即分配系数。

如果某一混全物的各组分在这两相中的分配系数有足够的差异，它们就可以被分离。

3．氨基酸的极性大小及各氨基酸结构
一、实验目的
１．通过氨基酸的分离，学习纸层析法的基本原理及操作方法
２．掌握氨基酸纸上层析法的操作技术（点样、平衡、展层、显色、鉴定）
二、实验原理
纸层析法是分配层析的一种，以滤纸作为惰性支持物。

层析溶剂（扩展剂）由有机溶剂和水组成。

在纸上水被吸附在纤维素的纤维之间形成固定相。

由于纤维素上的羟基具有亲水性，和水以氢键相连，使这部分水不易扩散，所以能与跟水混合的溶剂仍然形成类似不相混合的两相。

当有机相沿纸流动经过层析点时，层析点上溶质就在水相和有机相之间进行分配，有一部分溶质离开原点随有机相移动而进入无溶质的区域，这时又重新进行分配，一部分溶质从有机相进入水相。

当有机相不断流动时，溶质就沿着有机相流动的方向移动，不断进行分配。

溶质中各组分的分配系数不同，移动速率也不同，因而可以彼此分开。

物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf 值（比移）来表示的。

在一定的条件下某种物质的R f 值是常数。

R f 值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统、P H 层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。

氨基酸、糖、核甘酸、甾体激素、维生素、抗生素等很多物质都能用纸上层析法分离。

上层层析、下层层析、单向层析、双向层析。

三、仪器、材料和试剂
仪器：每组学生准备尺子、小剪子或小刀
1．层析缸、培养皿、量筒、小烧杯、长颈漏斗、毛细管、吹风机、电热鼓风干燥箱、层析滤纸、手套 、透明胶带。

实验材料和试剂
1．标准氨基酸溶液 分别配制0.5%的Lys 、Ala 、Ile 、Met 溶液
2．待分离测定的混合氨基酸溶液
３．显色剂 0.1%水合茚三酮丙酮溶液。

４．扩展剂（展层剂）：本实验使用酸溶剂系统
α＝ 物质在溶剂II 中的浓度 物质在溶剂I 中的浓度 R f ＝ 原点到溶剂前沿的距离 原点到层析点中心的距离
酸溶剂系统：正丁醇:80%甲酸:水＝15:3:2（体积比），平衡溶剂与扩展剂相同。

四、操作步骤
１．层析缸：三个组共用一个。

层析缸中放入三个培养皿（注意垫平）。

２．配制酸溶液系统：每组用量筒用配制30ml入小烧杯，再放入层析缸中，作为平衡溶剂，密闭。

问题：平衡溶剂的作用是？
3．戴手套取层析滤纸一张。

在纸的一端(纵纹)距边缘1.5~2cm处用铅笔划一条直线，而后进行分隔（５个点）。

问题：为什么戴手套取层析滤纸？
4．练习点样：用毛细管吸水在滤纸条上练习。

达到均匀透过滤纸，大小不超过3mm的点样迹。

5．正式点样：用毛细管将各氨基酸样品分别点在这5个位置上，干后再点一次。

注意：两次点样一定不要将不同的样品点在一个点上。

小组成员认真仔细合作。

不要用手触摸到滤纸。

6．点样面朝外，纸的两边不能接触。

用胶带小条（1~2mm宽）将滤纸粘成筒状。

7．将筒状滤纸直立于培养皿中（点样的一端在下），盖上层析缸盖，平衡约.10分钟。

8．将长颈漏斗置于筒状滤纸中并与培养皿底部接触，将约25mL左右扩展剂（即平衡溶剂）沿长颈漏斗倾于培养皿，扩展剂的液面需低于点样线1cm。

密闭。

问题：为什么加入的展层剂的液面需低于点样线？
9．展层：当溶剂展层至距离纸的上沿约1厘米时，取出滤纸，立即用铅笔标出溶剂前沿界线，自然干燥或用吹风机热风吹干。

10．显色：将已层析的滤纸用摄子夹住边，在0.1%茚三酮丙酮溶液中双而均匀浸透后拿出，然后置烘箱（65℃）烘烤5分钟。

问题：除哪几种氨基酸和茚三酮反应产生黄色物质？其它α－氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮产生兰紫色物质。

其原理是？
五、实验结果与分析讨论
1．计算各种氨基酸的R f并排出迁移率顺序。

2. 确定混合液中氨基酸成分。

3. 从氨基酸结构解释待测的几种氨基酸R f大小不同的原因
４．分析讨论异常状况。

六、注意事项
思考题
1．分配层析法指的分配系数的含义
2．层析缸中平衡溶剂的作用是什么
3．影响R f值的因素有哪些?
４．哪几种氨基酸遇茚三酮反应产生黄色物质？。