绿色木霉生长在膨化纤维素平板上形成产酶透明圈
纤维素酶酶活表示方法
1、滤纸酶活（FPA，FPase）
以滤纸为酶反应底物，该酶活反映综合酶活力，更主要 反映外切酶活
2、羧甲基纤维素钠酶（CMCase)
以CMC为酶反应底物，主要测定内切酶活性
3、 Avicelase 酶活
以微晶纤维素Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活 性
• 张苓花等采用康氏木霉W-925经过硫酸二乙酯和紫外线复 合诱变，筛选得到产酶活性高的菌种Wu-932 ，该菌种CMC 糖化力达到2975 u/g，滤纸糖酶活性为531U/g，比出发菌 W-925分别提高了100%和81%。
• 化工部饲料添加剂技术服务中心采用里氏木霉A3进行紫外 线和亚硝基胍复合诱变后，将处理过的孢子接种于纤维双 层平板上，30℃培养5-8天，15℃放置7-10天，挑选透明 圈直径和菌落直径比较大的单菌落进行三角瓶固态发酵再 筛选，得到了产纤维素酶活力很高的里氏木霉91-3菌株。
β-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶）
（2）以PNPG（对-硝基苯-β-D-葡糖苷）为底物测定 • 取适当稀释的酶液0.1ml于10ml试管中，放入50℃
水浴中预热2-3min，加入0.9 ml 0.1%PNPG溶液 （用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计 时，50℃反应30min后，加入1ml 2%Na2CO3溶液终 止反应，摇匀后，用721分光光度计测定对-硝基苯 在410nm波长下的吸光度。以去离子水代替酶液， 同上操作，为参比（OD=0）
纤维素酶基因工程菌构建
• 20世纪80年代以后一直至今，以纤维素酶过 量生产为主要目的，构建高产纤维素酶基因工 程菌的研究十分活跃。
• 目前里氏木霉(T reesei)纤维素酶中的 • 内切酶：EGI、EGIII和EGV基因 • 外切酶：CBH I , CBH II， • β-葡萄糖苷酶：βGI，βGII • 等纤维素酶中各组分蛋白分子量，氨基酸残基
产纤维素酶的主要微生物
纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体 动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产 生纤维素酶。其中微生物主要的有： 霉菌类：
康氏木霉(Trichoderma koningii) 绿色木霉（ Trichoderma viride) 里氏木霉（ Trichoderma reesei ） 腐殖菌（Humicola insolens） 黑曲霉(Aspergillus niger) 斜卧青霉(Penicillium decumbens)、 解纤维顶孢霉(Acremonium cellulolyticus)等。
• （以Avicel为酶反应底物，主要测定外切酶活性）
• Avicel为微晶纤维素，由于Avicel本身有少量还原 糖干扰测定，所以需用去离子水洗涤Avicel 2-3次， 去除还原糖，洗涤烘干后的Avicel作为酶活测定的 底物。
• 称取50mg Avicel，放入20毫升试管底部，加入2ml pH4.8 0.1M Hac-NaAc 缓冲液，放入50℃水浴中预 热2-3min，加入适当稀释酶液0.5ml，立即计时， 50℃振荡反应1h，加入3ml DNS溶液终止反应，沸 水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子水， 摇匀后，4000-5000rpm离心5min,上清夜用721分光 光度计于535nm波长下，测定吸光度。以去离子水 代替酶液，同上操作，为参比（OD=0）。
纤维素酶高产菌株
70-80年代国外主要采用诱变育种方法获得筛 选高产菌，包括随机诱变和有目标诱变，其主要 策略是： 1、解除分解代谢阻遏，解除葡萄糖、甘油等易分解 代谢碳源对产酶阻遏，或筛选2-deoxyglucose抗 性。 2、提高酶的胞外分泌性，如筛选对细胞壁合成抑制 作用的化学物质抗性菌株 3、筛选β -葡萄糖苷酶高产菌株，设计βglucosidase作用的有色底物，获得解除分解代谢 阻遏高产突变株。
代表性菌株高产菌株
国外代表性菌株有 Trichoderma reesei QM9414, Rut C-30, MCG-77, MCG-80, CL-287, 41G
KDR-11,KDG-12,KDD-10等。
国内菌种诱变选育情况
• 王家林等对康氏木霉NT-15进行紫外线、电 磁波辐射、线性加速器，亚硝基胍等物理、 化学的诱变方法，获得了高产菌株NT15-H, 固体培养滤纸活力为3670u/g, Cx酶活力 1800U/g，此菌种在工厂化生产中性能稳定。
组成，基因长度与序列均已被调查清楚。
纤维素酶基因工程菌构建策略
• 由于纤维素酶是一个多酶体系，要得到一个有实 际应用价值的纤维素酶，大多采用产纤维素酶菌 种Trichoderma reesei为外源基因的表达宿主，采 用基因工程手段改造里氏木霉，提高产酶活力。
果汁加工、功能性成分提取
中草药成分提取
纤维素酶水洗牛仔裤
秸秆酒精流程
影响纤维乙醇产业化的主要因素
（1）木质纤维素预处理技术有待进一步优化和提高。由于天然 纤维素原料的结构复杂的特性，使得其纤维素、半纤维素和 木质素三者不能有效分离；另外伴随产生一些中间副产物， 实验表明，这些物质抑制酵母的生长和代谢，最终影响乙醇 产率。
维素链开裂，长链分子的末端部分游离，从而使 纤维素链易于水化。内切酶Cx酶随机水解非结 晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和纤维寡糖、纤 维糊精， β-葡萄糖苷酶将纤维二糖和纤维三糖水 解成葡萄糖。
纺织
棉布后整理、生物抛光
饲料工业
饲料酶、秸秆青贮
酒
啤 酒
应用
精 发
工 业
酵
玉米酒精
食品及
红薯酒精
发酵工业
秸秆酒精
羧甲基纤维素钠酶活（CMCase）的测 定
（以CMC为酶反应底物，主要测定内切酶活性）
• 取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放入 50℃水浴中预热2-3，加入2 ml 1%CMC溶液（用 pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓冲液配制），立即计时， 50℃反应30min后，加入3ml DNS溶液终止反应， 沸水浴煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子 水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波长下， 测定吸光度。以去离子水代替酶液，同上操作， 为参比（OD=0）
酸性纤维素酶是一种具有3—10个或更多个组分构成的多 组分酶。依其作用可分为: β-1，4-内切葡聚糖酶（Endo-β-Glucanase ，简称 EG,Cx）,主要作用于无定形纤维素,水解产生纤维糊精,纤 维寡糖. β-1,4-外切葡聚糖（纤维二糖水解）酶（Cellobiohydrolase， CBH,C1 ）,主要作用于结晶纤维素,产生纤维二糖. β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，βG）,水解纤维二糖为葡 萄糖。
• 中科院微生物研究所董志扬等用康宁木霉通过γ射 线照射和亚硝基胍交替处理，诱变出一株纤维素 酶高产菌株T801，其产酶能力提高1.77倍。
• 青岛海洋大学管斌等对里氏木霉进行低剂量、反 复多次紫外线、亚硝基胍复合诱变处理方法，用 “以2-脱氧葡萄糖作为降解产物阻遏物”高效筛 选方法，选育得到一株抗分解代谢阻遏的突变株， 纤维素酶活力提高三倍。
植物纤 维素的高聚 合度、毛细 管结构、本 质素和半纤
维素所形成 的保护层及 其超分子结
构中具有高 结晶度 (crystallin ity index) 的结晶区存
纤维素的显微结构
纤维素酶 组成成份及其特征
纤维素酶是生物炼制中的一种重要关键酶。
是水解纤维素β-1，4-葡萄糖苷键，使纤维素变成纤维二糖 和葡萄糖的一组酶的总称，它不是单一酶，而是起协同作 用的多组分酶系。
纤维素的利用前景诱人，但难度不小。
地球每年陆生植物可产纤维素约5×1011吨 (5000
亿吨), 我国每年秸秆6-7亿吨
合成速率相当于全人类每人每天70千克 是地球上最丰富的再生资源,约占地球生物总量的 60% 。 80％纤维素未被开发利用
纤维素生物质
纤维素分子 是由许多吡喃型 D-葡萄糖残基通 过β-1,4-糖苷键 连接起来的线形 高分子聚合物， 分子量约 600000——15000 00，聚合度从几 百至1500左右。 其链呈带状，链 内与链间都有氢 键。其中，链内 氢键通过葡萄糖 上6位的OH和相邻
4、β-葡萄糖苷酶
以水扬素为底物测定；以PNPG（对-硝基苯-β-D-葡糖 苷）为底物测定。
纤维素被纤维素酶水解所产生的还原糖一般用DNS试剂 检测。
纤维素酶活力的定义
• 在pH4.8，50℃ 条件下测来自,酶活单位定义 为水解底物每分钟产生1μmol葡萄糖（或产 物）为1个活力单位。
Avicelase 酶活的测定
天然纤维素酶解过程可分三个阶段：
首先是纤维素对纤维素酶的可及性 其次是纤维素酶的被吸附与扩散过程 最后是由EG、CBH和βG自组织复合 体协同作用降解纤维素的结晶区，同时 由EG、CBH和βG随机作用纤维素的无 定形区。
结晶纤维素 葡萄糖
C1 无定形
纤维素 Cx
βG
纤维
二糖
外切酶C1酶作用于不溶性的固体表面,疏松纤维 素结晶结构并起水化作用，使形成结晶结构的纤
纤维素刚果红培养基法： 纤维素能同刚果红染料形成红色，而纤维素酶的 水解产物纤维糊精、纤维二糖和葡萄糖不能同刚 果红染料形成红色沉淀，为浅黄色，所以在纤维 素刚果红培养基上，凡能形成浅黄色水解圈的菌 落即是能产纤维素酶的菌株，还可以根据水解圈 的大小（产酶能力强水解圈大），估计菌株产酶 的情况，筛选高产菌株。
β-葡萄糖苷酶（也称纤维二糖水解酶）
（1）以水扬素为底物测定
取适当稀释的酶液0.5ml于20ml试管中，放 入50℃水浴中预热2-3min，加入2 ml 1% 水杨素溶液（用pH4.8 0.1M Hac-NaAc缓 冲液配制），立即计时，50℃反应30min 后，加入3ml DNS溶液终止反应，沸水浴 煮5min，冷却至室温后，加入10ml去离子 水，摇匀后，用721分光光度计于535nm波 长下，测定吸光度。以去离子水代替酶液， 同上操作，为参比（OD=0）