华南农业大学综合实验报告实验项目名称:食品发酵工业中常用系列酶活力测定实验项目性质:综合性实验计划学时:6所属课程名称:食品与发酵工业分析班级:09生物工程2班******学号:************实验课指导老师:沈玉栋摘要测定食品发酵工业中常用酶活力,对于选择酶种类,工艺条件的制定等有重要意义。
本次实验中对工业常用系列酶——糖化酶,淀粉酶,蛋白酶进行了酶活力测定。
其中,测定糖化酶采用直接滴定法,测定淀粉酶采用目测比色法,测定蛋白酶采用福林酚法。
关键词:酶活力糖化酶淀粉酶蛋白酶直接滴定法目测比色法福林酚法1 前言酶,从早期的酿造、发酵食品开始,至今已广泛应用到各种食品上。
随着生物科技进展,不断研究、开发出新的酶制剂,已成为当今新的食品原料开发、品质改良、工艺改造的重要环节。
目前已有几十种酶成功地用于食品工业。
例如,葡萄糖、饴糖、果葡糖浆的生产、蛋白质制品加工、果蔬加工、食品保鲜以及改善食品的品质与风味等。
应用的酶制剂主要有:淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、葡萄糖异构酶、果胶酶、脂肪酶、纤维素酶、葡萄糖氧化酶等。
酶作为生物体内的一种具有催化活性的蛋白质,生物体内几乎所有的反应都离不开没的催化。
作为生物体内的催化剂,催化效率——即酶的活力是酶的一个重要的的指标。
酶活力的大小可用在一定条件下,酶催化某一化学反应的速度来表示,酶催化反应速度愈大,酶活力愈高,反之活力愈低。
测定酶活力实际就是测定酶促反应的速度。
酶促反应速度可用单位时间内、单位体积中底物的减少量或产物的增加量来表示。
在一般的酶促反应体系中,底物往往是过量的,测定初速度时,底物减少量占总量的极少部分,不易准确检测,而产物则是从无到有,只要测定方法灵敏,就可准确测定。
因此一般以测定产物的增量来表示酶促反应速度较为合适。
糖化酶,又称葡萄糖淀粉酶、γ-淀粉酶。
它能把淀粉从非还原性未端水介a-1,4葡萄糖苷键产生葡萄糖,也能缓慢水解a-1,6葡萄糖苷键,转化为葡萄糖。
同时也能水解糊精,糖原的非还原末端释放β-D-葡萄糖。
采用可溶性淀粉为底物,在一定的pH值与温度下,使之水解为葡萄糖(还原糖),以直接滴定法测定。
淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称,通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料。
淀粉酶的种类很多,根据酶水解产物异构类型的不同可分为α-淀粉酶与β-淀粉酶。
液化型淀粉酶(又称α-1,4糊精酶,俗称α-淀粉酶)能水解淀粉中α-1,4葡萄糖苷键,水解淀粉为分子量不一的糊精,淀粉迅速被液化。
使淀粉与碘呈蓝紫色特征反应逐渐消,以该颜色的消失速度计算酶的活力的高低。
蛋白酶是水解蛋白质肽键的一类酶的总称,广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。
微生物蛋白酶,主要由霉菌、细菌,其次由酵母、放线菌生产。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物),由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等),可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物,在一定pH值和温度条件下,同酶液反应,经一段时间后终止酶促反应,经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液,用Na2CO3碱化,再加入福林-酚试剂显色,蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比; 酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定,从而计算出蛋白酶的活力。
2 实验材料和仪器2.1实验材料碱性酒石酸铜甲溶液、0.1%标准葡萄糖溶液、pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液、0.1mol/L氢氧化钠溶液、2%可溶性淀粉溶液、固体曲、稀碘液、2%可溶性淀粉溶液、0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠——柠檬酸缓冲液、标准终点比色液、液化型淀粉酶粉(即α-淀粉酶粉)、福林酚试剂、0.02mol/LpH7.5磷酸缓冲液、标准酪氨酸溶液(50μg/mL)、酪蛋白溶液(0.5%)。
2.2 实验仪器滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶、试管、三角瓶、滴管、移液管、恒温水浴、白瓷板、纱布、恒温水浴锅、分光光度计、试管及试管架、干燥滤纸、玻璃漏斗。
3 实验步骤3.1 糖化酶活力测定3.1.1 5%固体曲浸出液制备:称取5.0g固体曲(以绝干曲计),置于250mL 烧杯中,加90mL水和10mL pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液,搅匀,于30℃水浴中保温浸1小时,每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤,滤液为5%固体曲浸出液。
3.1.2 固体曲糖化液的制备:吸取25mL 2%可溶性淀粉溶液,置于50mL容量瓶中,于30℃水浴预热10min。
准确加入5mL 5%固体曲浸出液,摇匀,立即记下时间。
于30℃水浴准确保温糖化1小时。
迅速加入15mL 0.1mol/L氢氧化钠溶液,终止酶解反应。
冷却至室温,用水定容至刻度。
同时作一空白液:吸取25mL 2%可溶性淀粉溶液,置于50mL 容量瓶中,先加入15mL 0.1mol/L 氢氧化钠溶液,然后准确加入5mL 5%固体曲浸出液,用水定容至刻度。
3.1.3 定糖:空白液测定:吸取碱性酒石酸铜甲、乙液各5mL ,置于100-150mL 三角瓶中,准确加入5mL 空白液,并用滴定管预先加入适量的0.1%标准葡萄糖溶液,使滴定时消耗的0.1%标准葡萄糖溶液在1mL 以内,摇匀。
于电炉上加热至沸腾,立即用0.1%标准葡萄糖溶液滴定至蓝色消失,此滴定操作需在1min 内完成。
糖化液测定:准确吸取5mL 糖化液代替5mL 空白液,其余操作同上。
3.1.4 结果计算固体曲糖化酶活力定义:1g 绝干固体曲,在30℃、pH4.6、1小时内水解可溶性淀粉为葡萄糖的毫克数。
100015100550-0⨯⨯⨯⨯⨯=WC V V )(糖化酶活力 式中:V 0——5mL 空白液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积(mL )V ——5mL 糖化液消耗0.1%标准葡萄糖溶液的体积(mL ) C ——标准葡萄糖溶液浓度(g/mL )50/5——5mL 糖化液换算成50mL 糖化液中的糖量(g ) 100/5——5mL 浸出液换算成100mL 浸出液中的糖量(g ) W ——绝干曲称取量(5.0g) 1000——g 换算成mg3.2.淀粉酶活力测定 3.2.1 待测酶液的制备精确称取酶粉2.0000g ,先用少量的40℃0.02mol/L pH6.0的磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲溶液溶解,并用玻璃棒捣研,将上层液小心倾入500mL 容量瓶中,沉渣部分再加入少量上述缓冲液,如此反复捣研3~4次,最后全部转入容量瓶中,用缓冲液定容至刻度,摇匀,40℃浸取30min ,然后,通过四层纱布过滤,滤液供测试用。
3.2.2 测定取2mL 终点标准指示液与白瓷板空穴内,作为颜色的标准。
取20mL2%可溶性淀粉溶液和5mL pH6.0磷酸氢二钠—柠檬酸缓冲液,注入150mL 三角瓶中,在60℃恒温水浴中预热5min ,然后加入预先稀释好的酶液0.5mL ,立即记录时间,充分摇匀,定时用滴管取出反应也约0.5mL 。
滴于预选充满比色稀碘液(约1.5mL)的白瓷板空穴内,当空穴内颜色反应由紫色逐渐变为红棕色,与标准终点指示颜色相同时,即为反应终点,记录时间T (min)。
3.2.3 结果计算以1g 酶粉(或1mL 酶液)于60℃,pH6.0的条件下,1小时液化可溶性淀粉的克数来表示(g/g •h 或g/mL •h)。
5.0/%22060⎪⎭⎫⎝⎛⨯⨯⨯=n T 酶的活力单位 式中 n ------酶粉稀释倍数;2%------淀粉溶液浓度;20------可溶性淀粉吸取体积(mL); T ------测定记录时间(min);0.5-----测定时所用酶液体积(mL);3.3 蛋白酶活力测定 3.3.1 标准曲线的绘制L-酪氨酸标准溶液:按表1配制。
L-酪氨酸稀释液应在稀释液应在稀释后立即进行测定。
表1分别取上述溶液各1.00mL(须做平行试验),各加碳酸钠溶液5.00mL、福林试剂使用溶液1.00mL,振荡均匀,置于40±0.2℃水浴中显色20min,取出,用分光光度计于波长680nm,10mm比色皿,以不含酪氨酸的0管为空白,分别测定其吸光度。
以吸光度A为纵坐标,酪氨酸的浓度c为横坐标,绘制标准曲线。
利用回归方程,计算出当吸光度为1时的酪氨酸的量(ug),即为吸光常数K值。
其K值应在95-100范围内,如不符合,需重新配制试剂,进行试验。
3.3.2 待测酶液的制备称取酶样品1-2g,精确至0.0002g。
然后用相应的缓冲液溶解并稀释到一定的浓度,推荐浓度范围为酶活力10-15u/mL。
对于粉状的样品,可以用相应的缓冲液充分溶解,然后取滤液(慢速定性滤纸)稀释至适当浓度。
3.3.3 测定步骤3.3.3.1 先将酪蛋白溶液放入40±0.2℃恒温水浴中,预热5min。
3.3.3.2 按下列程序操作:试管A(空白)试管B(酶试样)↓↓加酶液1.00mL 加酶液1.00mL↓40±0.2℃,2min ↓40±0.2℃,2min加三氯乙酸2.00mL(摇匀)加酪蛋白溶液1.00mL(摇匀)↓40±0.2℃,10min ↓40±0.2℃,10min加酪蛋白溶液1.00mL(摇匀)加三氯乙酸2.00mL(摇匀)↓↓取出静置10min,过滤(慢速定性滤纸)取出静置10min,过滤(慢速定性滤纸)↓ ↓取1.00mL 滤液 取1.00mL 滤液 ↓ ↓加碳酸钠溶液5.0mL 加碳酸钠溶液5.0mL ↓ ↓加福林试剂使用溶液1.00mL 加福林试剂使用溶液1.00mL ↓40±0.2℃,显色20min ↓40±0.2℃,显色20min 于680nm 波长,用10mm 比色皿测定吸光度 于680nm 波长,用10mm 比色皿测定吸光度3.3.3 结果计算从标准曲线上读出样品最终稀释液的酶活力,单位为u/mL 。
101m 41111⨯⨯⨯⨯=n V A X其中,X——样品酶活力,u/gA 1——由标准曲线得出的样品最终稀释液的活力,u/mL V 1——溶解样品所使用的容量瓶体积,单位为mL 4 ——反应试剂的总体积,单位为mL n 1——样品的稀释倍数m 1——样品的质量,单位为克(g )101——反应时间10min ,以1min 计所得结果表示至整数。
4 数据处理与分析4.1固体曲糖化酶活力测定 4.1.1数据处理表1 糖化酶活力测定实验滴定所用滴定液体积组别 1 2 3 平均值 空白试样(ml )9.769.7010.129.86样品试剂(ml )5.45 5.38 5.38 5.41由于V 0=9.86,V=5.41,c=0.001 g/mL ,W=5.0g ,X=178 4.1.2 结果分析实验结果表明试样蛋白酶活力为178,根据查找的资料可知本实验所用酶活力偏低。