葉下株(Phyllanthus urinaria)之自由基清除抑制活性評估摘要自古醫學典藉中就發現,葉下株(Phyllanthus urinaria)具有優異的抗氧化能力,所以本研究期望藉由葉下株的抗氧化能力、DPPH自由基清除率、Trolox當量抗氧化能力(TEAC)、總多酚含量(TPC)活性評估測試,評估將葉下株研發美容保養品潛力。
本實驗以丙酮浸泡葉下株來進行萃取,分出18個粗分層及水層、油層,再從這些粗分層來進行DPPH、TEAC、TPC三種方式分析其抗氧化能力,本研究顯示,在抗氧化分析方面,DPPH抑制效果、粗分層樣本越後層清除率越高,粗分層第15、16、18層與油層濃度1000 ppm清除率均超過50%,水層清除率更達95%以上;TEAC在粗分層第9層後抗氧化能力普遍較佳,在濃度1000 ppm第9、10、11、16、水、油、粗萃層均超過50%,其中粗分層第18抑制率達95%以上;總多酚定量測試,粗分層第15、18、水層含有相當於106.5986 mg、84.14966 mg、76.66667 mg之Gallic acid。
綜合以上數據,葉下株是非常具有開發潛力的中藥材,希望更進一步研究,應用在中草藥化粧品方面。
前言近年來隨著國際趨勢變化,使得中草藥越來越受重視,且逐漸蔚為風潮。
而隨著中草藥的開發,全球各地掀起了一股崇尚自然的熱潮,不僅於醫藥上,保健食品、美容化妝品也漸漸受到市場的青睞,人們越來越瞭解中草藥並不像西藥或其他化學藥品單一個組成或成分,其作用也單方向與單純反應機制,所以紛紛轉向天然漢方草本為主,減少化學上的副作用。
現今許多天然物抗氧化應用的研究,已從食品藥物領域延伸至化妝品上的應用,化粧品添加天然物已成不忽視趨勢,所以有效的結合化妝品與中草藥上技術,更提升雙方附加價值,使化粧品產業逐年成長,也讓相關產業得以蓬勃發展,可看出中草藥在化妝品上潛力無窮的商機。
本研究自民間常見草藥,葉下珠(Phyllanthus urinaria),屬於大戟科油柑植物,別名珍珠草,是一種小型藥草,廣泛的生長在熱帶和亞熱帶的中國、印度、南美洲,數百年前就已經是中國民間藥物,根據過去文獻研究報告指出葉下珠可以抗B 型肝炎病毒作用、抗肝細胞損傷作用、抗發炎作用、抗細菌作用、抗氧化與保護心臟作用、消除DPPH radical、超氧陰離子自由基(superoxide anion radical)、過氧化氫(hydrogen peroxide)、一氧化氮(nitricoxide)等自由基作用1-3。
根據許多文獻報導人類體內自由基主要是由氧在體內轉變成活性氧族(reactive oxygen species,ROS)及具有活性的氮氧化合物(reactive nitrogen species,RNS)如過氧化脂質(lipid hydroperoxide)、單旋氣(single oxygen)4。
它們會攻擊人體細胞膜上的多聚不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid,PUFA)及各種胺基酸,造成養化傷害或基因異常表現等因素導致這種疾病,例如癌症、糖尿病、氣腫、動脈粥狀硬化、腦血管病變等5-6,綜合前述對自由基,可歸類下列幾種7:(一)超氧陰離子自由基(superoxide anion radical)O-2.通常是最常產生的自由基,在人體內的吞噬細胞及粒腺體中的電子等均會產生超氧陰離子自由基。
但半衰期極短,可是會造成自由基會連鎖反應,接著產生的二級產物、三級產物等,將會造成傷害。
(二)過氧化氫(hydrogen peroxide)H2O2過氧化氫對細胞的傷害性較大,因為它通過細胞膜和體內轉運中的鐵和銅發生fenton反應,產生羥基自由基(HO.)過氧化氫可活化heme protein、hemoglobin和myoglobin,成為含鐵化合物,而這些化合物會促使細胞的脂質過氧化。
(三)羥基自由基(hydroxyl radical)HO.羥基自由基算是最會跑的自由基之一,除了自由基轉換之外,在很多情況下也會大量產生HO.。
它會造成體內脂質過氧化進一步破壞細胞,且會和胺基酸、核醣體、磷脂質等生物體內反應。
多元不飽和脂肪酸(PUFA)和羥基自由基關係非常密切,普遍認為一個HO.會因連鎖反應產生數百個PUFA 的過氧化。
(四)單旋氣(single oxygen)1O為體內穩定的氧,受紫外線照射後出現不穩定現象,且極易與氫反應,直接攻擊不飽和脂肪2酸,造成自由基物及脂質氧化。
(五)過氧化脂質(lipid hydroperoxide)LOOH過氧化脂質是許多自由基物反應完的產物,且大部分發生在細胞膜上和脂肪酸。
過氧化脂質也會產生有害的醛類、鹼類或其它產物。
過氧化脂質或其它產物會和酵素、蛋白質、核酸作用,造成細胞病變或死亡。
隨著年紀增長生理機能及器官逐漸下降,在加上外在環境因素,使體內自由基更加活躍,所以在膳食中增加蔬果或草藥攝取量,可降低相關疾病發生8。
由於他們當中含有極性與非極性化合物可作為氫離子、還原劑、活性氧清除物,因此具有抗氧化能力,減少細胞受氧化的傷害9,使得人類壽命逐年增長,減少老化以成現今大家重視議題,因此如何清除體內過多自由基已被定義為防禦醫學一環,也就是在人體老化以前,就先給予預防,這樣能降低許多因自由基而引起的相關疾病及老化例如癌症、動脈硬化、心血管疾病、老年痴呆等,這些疾病都被認為與自由基相關10-12。
隨著政府推動綠色生態產業和民眾環保意識抬起,與化學物質藥物相比,中草藥接受意願頗高,業界爭相開發,紛紛開發天然植物活性成分產品,以爭取中藥化妝品商機。
本研究採非細胞抗氧化實驗,以DPPH自由基清除能力、TEAC總抗氧化能力、TPC含量檢測,評估葉下株在抗氧化方面的潛力,並討論葉下株在化妝品上的應用潛力,藉本研究來評估葉下株體內的抗氧化功能及抗氧化能力的相關性。
2-2藥材之萃取2-2-1葉下株丙酮萃取物(1)取996.2 g 葉下株,剪碎後浸泡於95%丙酮中3天。
(2)使用濾紙抽氣過濾,收集萃取液。
(3)真空濃縮機40。
C左右減壓濃縮回收丙酮。
(4)可得萃取物,再放置天秤得知萃取物重量。
(5)置入-20。
C冰箱保存備用。
2-2-2配比分離(Partition)(1)將葉下株粗萃物加入乙酸乙酯(Ethylacetate)與去離子水(1:1)進行Partition。
(2)靜置分層後,再分別收集水層及EA層。
(3)接著將水層重複前述步驟Partition兩次,使水層志清澈為止。
(4)最後收集三次EA層和水層之萃取液進行濃縮。
(5)濃縮後置入-20。
C冰箱保存備用。
2-2-3水蒸餾法(1)磨碎機磨碎葉下株,分別取100 g粉末與350 ml二次水混合後。
(2)加熱迴流3小時萃取。
(3)使用濾紙抽氣過濾,收集萃取液。
(4)真空濃縮機濃縮。
(5)置入-20。
C冰箱保存備用。
2-2-4矽膠管住層析(1)使用n-Hexane、Acetone、MeOH三種不同溶劑。
(2)逐步增加極性之比例混合沖提。
(3)依極性大小共獲得18個粗分層。
(4)將這18個粗分層濃縮機乾操。
(5)置入-20。
C冰箱保存備用。
2-4分析方法2-4-1清除1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (DPPH)自由基能力之測定13藥劑與藥品1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazylMethanol(友和公司)測定方法乃參考Chu(2003)之進行。
分別在96 well盤中加入50 μl,於測試前再加入150 μl 400 μM 新鮮配置之DPPH 溶液(0.0157 g 溶於100 ml 之80%甲醇),及控制組和對照組,於溫度25℃下均勻混合90分鐘後,在使用波長為517 nm 偵測反應前及反應後的吸光值,在代入清除自由基公式及,清除率%=[1-(檢品吸光度-檢品空白吸光度)/(對照組吸光度-對照組空白吸光度)]*100。
2-4-2 Trolox當量的抗氧化能力(Trolox Equivalent Antioxidant Capacity, TEAC)測定14藥劑與藥品ABTS35% H2O2PeroxidaseMethanol(友和公司)測定方法乃參考於,配製好的ABTS∙+、H2O2、Peroxidase ,經vortex 混合均勻後,室溫下靜置避光反應1小時。
1 小時後取出,分別在96 well盤中加入溶於180 μL ABTS∙+自由基溶液、待測樣本溶液20 μL,總體積為200 μL,另外在96 well盤中製作控制組20 μL 甲醇、180 μL ABTS∙+自由基溶液,及對照組Trolox(1000ppm)1 μL、19 μL 70 %甲醇、180 μL ABTS∙+自由基溶液,經vortex 混合均勻,於室溫下反應10 分鐘。
對照組中不加樣品,以等量甲醇取代。
最後使用紫外線/可見光分光光譜儀檢測其720 nm波長,根據Trolox 和吸光值關係算出標準取線,將樣本數據代入可得樣本TEAC值。
2-4-3總多酚含量(total phenolic contents)測定藥劑與藥品Galic acid(Sigma)Methanol(友和公司)Folin & Cionclteu,s phenol reagent(Sigma)sodium carbonate(JT)標準品配置將gallic acid用Methanol稀釋濃度分別於250 ppm 、125 ppm、62.5 ppm、31.25 ppm、15.625 ppm、0 ppm之標準液。
測定方法乃參考大同大學之進行,總酚量(total phenolic contents)之測定係採Folin-Ciocalteu reagent來測定樣本總酚含量,沒食子酸(gallic acid)做為標準曲線與樣品對照,先配置好sodiumcarbonate 20%(2 g溶於8 ml去離子水),再將2 N Folin-Ciocalteu稀釋成1 N Folin-Ciocalteu,分別加入400 ppm、200 ppm、100 ppm、50 ppm、25 ppm、0 ppm於離心管中,隨後加100 μL Folin-Ciocalteu’s reagent均勻混合後,靜置20分鐘。
最後加sodium carbonate 200 μL混合均勻,靜置反應10分鐘後,於離心10000 rpm 10分鐘,取上清液使用750 nm波長測定吸光直,將樣品吸光直代入沒食子酸相對量gallic acid equivalent(GAE),換算每克樣本含多少總酚含量。
結果與討論蔬果植物含有很多抗氧化物質成份,包括類黃酮、維生素C、維生素E、胡蘿蔔素、酚成分等,可以減少氧化傷害以及降低疾病發生。