小球藻优良藻种的选育与特性研究吴晓娟，刘海燕，顾继锐，罗国强（成都通威水产科技公司，四川成都 610081）摘要：本文研究了在相同培养条件下，11株小球藻的生长、光能利用率、色素以及蛋白质含量。

实验结果显示，分离自成都本地的小球藻C5生长速度上具有很强的优势，达到0.031 g/(L·d)，可溶性蛋白含量为44.73%，叶绿素含量达到29.05 mg/g，类胡萝卜素的含量达到15.35 mg/g。

因此，实际生产过程中可以选用小球藻C5作为生产藻种。

关键词：小球藻；生长速率；光能利用率；蛋白含量；叶绿素a；类胡萝卜素文章篇号：1673-9078(2013)3-576-578Selection, Breeding and Characteristics of Chlorella StrainsWU Xiao-juan, LIU Hai-yan, GUJi-rui, LUO Guo-qiang(Chengdu Tongwei Aquatic Science and Technology Co. Ltd., Chengdu 610081, China) Abstract: Growth pattern and biochemical composition of eleven strains of Chlorella were studied under controlled culture situation. The chemical constituents were analyzed in terms of growth, light use efficiency, pigment and protein. Of eleven species, the C5 strain showed higher growth rate, about 0.031 g/(L·d). The content of soluble protein was 44.73%. The pigment concentration of chlorophyll a and carotenoid was 29.05 mg/g and 15.35 mg/g, respectively.Key word:chlorella; growth rate; light use efficiency; soluble protein; chlorophyll a; carotenoid近年来，小球藻作为营养功效食品，已经被人们广泛认识[1]。

小球藻是一种生长迅速的单细胞绿藻，光合效率高，能够高效的固定二氧化碳，同时积累丰富的蛋白质、不饱和脂肪酸、维生素、矿物质和色素等[2~3]。

其中，含有的小球藻生长因子能够有效的改善机体免疫功能，对微生物具有益生作用[4~5]。

小球藻资源的调查及筛选工作将为微藻的研究开发提供优良的种源，对小球藻的研发和产业化进程具有积极的推动作用。

不同的藻种在相同的培养条件下，在生长速度和营养物质的积累上都会有差异[6~7]。

因此，在小球藻工业化生产中，筛选性能优良的小球藻藻种是搞高产量和改善产品质量的基础。

本研究考察了不同来源的11株小球藻藻种在生长速度、光能利用率、色素以及蛋白质含量的差异，确定了最佳培养小球藻藻种。

1 材料与方法1.1 藻种小球藻：所用小球藻藻种为C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11，保藏于成都通威水产科技公司的藻种库。

1.2 培养基收稿日期：2012-09-12作者简介：吴晓娟(1983-)，女，工程师，研究方向：微藻利用和开发培养基为改良的SE（添加3.36 g/L NaHCO3，其它营养盐同SE），1.3 培养方法培养温度为25 ℃，光强为6000 lx，光暗周期12:12 LD。

每天摇动培养瓶4次。

初始pH调整到6.5~7.0，初始藻浓度为2×106个/mL，静置培养。

以藻细胞的生长速度、光能利用率、色素以及蛋白质含量确定出最优小球藻藻种。

1.4 细胞浓度以及生物量的测定取100 mL的藻液过滤到已知干重的滤膜上，用蒸馏水冲洗掉藻体上附着的盐分，放入烘箱中经80 ℃烘干24 h，放在干燥皿中冷却至少20 min后称重，即得到藻细胞的生物量[8]。

以新鲜培养基为空白，将藻液混匀后测定其680 nm波长下的吸光度，即得到藻细胞的浓度。

1.5 光能利用率根据能量守恒定律确定藻细胞的能量转换关系确定光能利用率Ψ的计算[9]。

Ψ=Pb*H biomass/F vol注：Pb：单位体积增加干重；Pb：单位体积增加干重；H bio mass：藻细胞燃烧热值；F vol：单位体积接收的光能(球状P AR 辐射测量仪测定光量子后计算)。

1.6 藻细胞可溶性蛋白质含量的测定采用考马斯亮蓝法[10]。

取一定量的藻液离心(5500576r/min，10 min)后进行冷冻干燥（-52±2 ℃，48 h）。

精确称取一定量的小球藻冷冻干燥粉，加20 mL水用进行破碎（400 W，30 min）后冻融，反复三次后，离心(5500 r/min，10 min)，取上清夜。

上清夜即为待分析藻细胞可溶性蛋白。

取样品提取液0.1 mL放入具塞试管中，加入0.9 mL蒸馏水稀释10倍，再加入5 mL 考马斯亮蓝G-250试剂，充分混和，放置5 min后用1 cm光径比色杯在595 nm下比色，记录OD595nm值，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量。

1.7 藻细胞色素含量的测定取一定量的藻液过滤，加入纯甲醇溶液置于4 ℃的低温条件下过夜，离心(4000 g、10 min)，取上清液，用分光光度计测定特定波长的吸光度值，根据吸光度值计算细胞色素含量，然后再换算为含量。

chl a含量计算公式为：chl a（μg/m L）=16.29×OD665-8.54×OD652，类胡萝卜素含量计算公式为：Carotenoid（μg/m L）=7.6×(OD480-1.49×OD510) [11] 2 结果与讨论2.1 11株小球藻生长特性的比较图1 11株小球藻藻种的生长曲线Fig.1 The growth rate of 11 Chlorella strains11株小球藻均经过2 d的延滞期后进入快速生长期，在培养的13 d内，各藻种在第3~10 d内快速增长，10 d后趋于稳定，OD680从初始0.001左右上升到1.5左右（图1）。

11株小球藻的比生长速率µ在第2天达到最高值后，随着时间的推移，呈下降的趋势，10 d后趋于稳定（图2）。

小球藻藻种C3的增长速率最大，达到0.037 g/(L·d)，其次为C7 0.036 g/(L·d)，而C5为0.031 g/(L·d)（图3），各组间差异显著（One-way ANOVA，p<0.01）。

从生长曲线和比生长速率µ看，小球藻在培养10 d时，各藻种都持续稳定生长，因此，培养小球藻时，可以选用10 d为一周期。

从生长特性看，小球藻藻种C3、C7、C5在11株小球藻种，具有生长优势，可以作为潜在的候选藻种。

图2 11株小球藻藻种的比生长速率Fig.2 The specific growth rate of 11 Chlorella strains图3 11株小球藻藻种的干重Fig.3 The dry weight of 11 Chlorella strains图4 11株小球藻的光能利用率Fig.4 The light use efficiency of 11 Chlorella strains 2.2 11株小球藻光能利用的比较光能利用率是衡量微藻生长能力的重要指标，本文测定了11株小球藻的光能利用率。

小球藻C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11的平均的光能利用率分别为0.357%、0.362%、0.536%、0.316%、0.448%、0.347%、0.529%、0.436%、0.227%、0.408%、0.477%（图4）。

其中小球藻C3的光能利用率最高，与其他小球藻种具有显著差异（T-test，p<0.05）。

，这一点说明C3小球藻有望作为工业化生产过程中的初始藻种，提高工业化生产过程中的能量利用率，降低成本。

2.3 11株小球藻可溶性蛋白质含量的比较577578 图5 11株小球藻藻种的可溶性蛋白含量Fig.5 The soluble protein content of 11 Chlorella strains 培养13 d后，小球藻C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11的的可溶性蛋白含量分别为181.7、266.9、253.1、275.8、447.3、373.1、302.7、365.4、276.2、416.2、324.8 mg/g（图5），其中小球藻C5的含量最高，达到了447.3 mg/g，与其他小球藻藻种在可溶性蛋白含量上具有显著性差异（T-test，p<0.05）。

蛋白质是小球藻细胞中有价值的化合物中的非常重要的一种，因此具有高蛋白质含量的小球藻是工业化生产的基础，而小球藻藻种C5在11株小球藻种的含量最高，可以作为候选对象。

2.4 11株小球藻色素含量的比较图6 11株小球藻的叶绿素a含量Fig.6 The chlorophyll a productivity of 11 Chlorella strains 小球藻细胞中的色素能作为食品，药物和化妆品的等的色素添加剂。

小球藻细胞中的叶绿素的含量高于现在商业上应用的脱水紫苜蓿的叶绿素含量[12]。

类胡萝卜素在生物体内起了十分重要的作用。

因此，小球藻细胞中的色素积累是衡量小球藻藻种性能的优良指标。

本此实验在培养13 d后，小球藻C1、C2、C3、C4、C5、C6、C7、C8、C9、C10、C11的叶绿素a （chl a）含量分别为30.39、31.27、22.22、37.67、29.05、38.68、19.08、29.08、38.93、36.00、28.99 mg/g（图6），类胡萝卜素（Car）含量分别为15.38、16.21、12.30、18.95、15.35、19.69、11.37、14.85、11.45、15.12、11.89 mg/g（图7）。

其中叶绿素a（chl a）含量最高的为小球藻C9，达到了38.93 mg/g，最低的为C7，仅为19.08 mg/g；小球藻藻种C6的类胡萝卜素含量最高，为19.69 mg/g。